細(xì)胞培養(yǎng)知識

VERO細(xì)胞培養(yǎng)、純化滅活的狂犬病毒

vero細(xì)胞 
　　Vero細(xì)胞被成功的用來培養(yǎng)狂犬病疫苗、乙腦疫苗等多種疫苗，在非典期間又為研究冠狀病毒做出貢獻(xiàn)，在醫(yī)藥研究種廣泛應(yīng)用。
來源： 非洲綠猴腎細(xì)胞 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：該細(xì)胞是日本千葉大學(xué)的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日從一只正常的成年非洲綠猴腎組織培養(yǎng)出來的。
培養(yǎng)液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10%胎牛血清
傳代：吸去培養(yǎng)液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1:3**1:6為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2-3次）
凍存： 95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
CHO-K1細(xì)胞 
 
 
 
　
　CHO-K1細(xì)胞是實驗中非常常用的一個細(xì)胞株，在生物制藥中使用也非常廣泛。該細(xì)胞株培養(yǎng)條件簡單，貼壁強(qiáng)度適中，比較容易轉(zhuǎn)染，很適合用它來研究一般哺乳動物基因的功能。
來源：Cricetulus griseus (中G倉鼠) 卵巢 形態(tài)：表皮細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：CHO-K1由CHO衍生而來，CHO是T. T. Puck 在1957年從一只成年中G倉鼠卵巢獲得的（1）。
培養(yǎng)液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）， 10% 胎牛血清。
傳代：吸去培養(yǎng)液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：4到1：8為宜，傳代期間培養(yǎng)液更換1-2次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
1. Puck TT , et al. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958. PubMed: 13598821
293細(xì)胞
　　
 
 
 
293細(xì)胞比較容易轉(zhuǎn)染，是一個很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。293細(xì)胞的一個衍生株：293T/17的轉(zhuǎn)染效率更高，成為廣大研究者研究基因功能的一個強(qiáng)大工具。
　　293細(xì)胞的缺陷是生長過程中貼壁強(qiáng)度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結(jié)果。如果一個實驗室新得到的293細(xì)胞是郵寄得到的并且細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中，就需要讓細(xì)胞沉降幾天時間，因為大量細(xì)胞會漂浮在培養(yǎng)液里。
來源：人體腎臟 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長特性：貼壁 注釋：該細(xì)胞含腺病毒5 DNA 。
培養(yǎng)液： MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10% 馬血清（熱滅活）。
傳代： 吸去培養(yǎng)液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：4為宜，傳代期間培養(yǎng)液2-3天更換1次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
NIH-3T3細(xì)胞
　
 
 
　NIH-3T3細(xì)胞在實驗室常用來做轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的研究。易感病毒有鼠肉瘤病毒和鼠白血病毒。
來源： Mus musculus（小家鼠）胚胎 形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣 生長特性：貼壁
注釋：為得到適合轉(zhuǎn)染得細(xì)胞株，NIH-3T3細(xì)胞**少連續(xù)克隆過5次。NIH-3T3細(xì)胞容易轉(zhuǎn)染DNA，鼠痘病毒陰性。
培養(yǎng)液：DMEM（含4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氫鈉），10%小牛血清
傳代：吸去培養(yǎng)液。（不要讓細(xì)胞長滿培養(yǎng)器皿，長滿80%為宜） 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以3-5x103/cm2為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2次）
凍存： 95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
PC-12細(xì)胞 
PC-12細(xì)胞是一個常用的神經(jīng)細(xì)胞株。
來源： Rattus norvegicus (褐家鼠) 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤）
形態(tài)：多角型細(xì)胞 生長特性：貼壁較松，容易成團(tuán)
注釋：PC-12細(xì)胞株來源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，該細(xì)胞對神經(jīng)生長因子（NGF）有可逆的神經(jīng)元顯形反應(yīng)，該細(xì)胞不合成腎上腺素。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
培養(yǎng)液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）+15%馬血清+2.5% 胎牛血清。
傳代：吸去培養(yǎng)液。 加入新的培養(yǎng)液，用吸管吹下細(xì)胞或用手拍打培養(yǎng)瓶或刮下細(xì)胞到培養(yǎng)液中，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：4為宜，傳代期間2-3天更換培養(yǎng)液）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
Hela細(xì)胞 
　
 
 
　Hela細(xì)胞是在所有細(xì)胞株中****的。它來源于美G的Helen Lane，她1951年死于子宮頸癌。但源自她的腫瘤的細(xì)胞卻在世界各地的實驗室中得到廣泛的使用。
來源：人宮頸癌 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：Hela細(xì)胞顯角蛋白免疫沉淀染色陽性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB和p53的低水平表達(dá)。
培養(yǎng)液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）， 10%胎牛血清
傳代：吸去培養(yǎng)液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：6為宜，每周傳代2-3次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
Sf9細(xì)胞 
　　Sf9細(xì)胞常在Baculovirus（桿狀病毒）表達(dá)系統(tǒng)中用作宿主細(xì)胞，來表達(dá)外源蛋白。
來源： Spodoptera frugiperda （草地夜蛾）卵巢細(xì)胞 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：Sf-9細(xì)胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年從細(xì)胞株IPLB-SF 21 AE得來的一個克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的。
培養(yǎng)液：TNM-FH培養(yǎng)液：照廠家的說明配好Grace's Antheraea 培養(yǎng)液，每升培養(yǎng)液加3.3g酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1M KOH調(diào)pH到6.2-6.4過濾除菌，4℃保存。完整培養(yǎng)液在使用前加入10%熱滅活的胎牛血清。
傳代：用吸液管吹洗細(xì)胞使其懸浮，或用手從側(cè)面拍打細(xì)胞培養(yǎng)瓶(當(dāng)用大細(xì)胞培養(yǎng)瓶時)重懸細(xì)胞。（當(dāng)用來接種的細(xì)胞重懸前就有很多細(xì)胞漂浮，要吸掉漂浮細(xì)胞及舊培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。 按合適比例傳代細(xì)胞到新培養(yǎng)器皿中。 （以1：5或更多為宜，每2-3天傳代一次） 28℃培養(yǎng)（不用CO2培養(yǎng)箱）。
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
BHK21細(xì)胞
來源：敘利亞倉鼠腎細(xì)胞 形態(tài)：纖維原細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：這個細(xì)胞來自于一只出生**的新生倉鼠，隨后被改造成一個易于作表達(dá)的宿主細(xì)胞株。
培養(yǎng)液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）+ 10%胎牛血清
傳代：吸去培養(yǎng)液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.03 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1：2到1：10為宜，每周傳代1-2次）
凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。
HepG2細(xì)胞
　　Hep G2細(xì)胞來源于一個15歲白人的肝癌組織。該細(xì)胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細(xì)胞能大容量培養(yǎng)，乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應(yīng)。
來源： 人肝癌細(xì)胞 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長特性：貼壁
注釋：該細(xì)胞表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。該細(xì)胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的環(huán)境下過氧化氫酶mRNA表達(dá)增加，ApoA-I mRNA 表達(dá)減少。
培養(yǎng)液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉）+ 10%胎牛血清。
傳代：吸去培養(yǎng)液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清會抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。（以1:4**1:6為宜，傳代期間培養(yǎng)液每周更換2次）
凍存： 95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。

DNA熒光染色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染

原理：利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測支原體污染。這種染料會結(jié)合到DNA的A-T福集區(qū)域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可將其染色而檢測。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA，證明有支原體污染。
特點(diǎn):簡單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行的檢測手段。可以檢測不易培養(yǎng)的支原體，例如M.hyorhinis，比直接培養(yǎng)法快，約一周既可知道結(jié)果。
缺點(diǎn)：有時會有背景熒光，影響結(jié)果判斷。
材料：
· Hank's balanced salt solution （不含NaHCO3 和酚紅，HBSS，GibcoBRL 21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M檸檬酸、0.2M磷酸氫二鈉、甘油、冰醋酸、甲醇、無菌水、chamber slide（Nunc 177380）或其替代物：35或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)放無菌22x22mm蓋玻片（浸于酒精中用前過火滅菌），染色后取出蓋玻片細(xì)胞面朝下放玻片上觀察。
· 指示細(xì)胞：Vero（ATCC CCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC CCL-96或CCRC60070），細(xì)胞須先測試無污染。MEM，10%FBS（Vero的培養(yǎng)液）。
試劑準(zhǔn)備：
· 無菌HBSS：配置Hank's balanced salt solution，用0.22um無菌濾膜過濾除菌。
· Hoechst 33258 儲存液（100x）：稱取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘**完全溶解后，以1ml/支分裝到1.5ml小離心管中，-20℃保存。
· Hoechst 33258 工作液：取1ml儲存液加入100ml無菌HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以錫箔紙包裹，避廣光保存于4℃。
· 封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M 檸檬酸和27.8ml0.2M Na2HPO4加入50ml甘油中，用1N NaOH調(diào)pH**5.5（pH很重要），4℃保存。
· 固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。
步驟：
1. 培養(yǎng)Vero細(xì)胞：Vero細(xì)胞可作長期培養(yǎng)或制作多個凍存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。
2. 在接種待測樣品前一日，將Vero細(xì)胞以1-2x104細(xì)胞/ml培養(yǎng)于chamber slide中，每孔加入1ml細(xì)胞懸浮液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后即可接種待測樣品細(xì)胞。
3. 接種待測樣品：樣品種類：1ml待測的培養(yǎng)基，1ml待測的細(xì)胞培養(yǎng)液（可刮下少許細(xì)胞）0.05-0.1ml 冷凍管的細(xì)胞懸浮液。
4. 將待測樣品加入chamber slide內(nèi)培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
5. 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero細(xì)胞作陽性對照，陰性對照用Vero細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基（MEM +10%FBS）。
DNA熒光染色檢測：
1. 取出培養(yǎng)5天的Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。每孔加2ml固定液，靜置十分鐘后吸除固定液，重復(fù)一次，風(fēng)干10分鐘。
2. 每孔加入1mlHoechst 33258 工作液，室溫下靜置30分鐘。
3. 吸掉Hoeshst 33258染液后，用無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴封固溶液，并以蓋玻片蓋之。
4. 用100-400x熒光顯微鏡觀察。打開汞燈10分鐘后，用UV激發(fā)光（330-380nm）的濾光鏡，觀察細(xì)胞核外是否有蘭色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)的熒光。
結(jié)果判斷：如有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會出現(xiàn)蘭色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成的不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其熒光可維持?jǐn)?shù)周。（見上圖）
怎樣查到一個特定細(xì)胞株的相關(guān)知識和培養(yǎng)條件？
　　ATCC (American Type Culture Collection) 收集了jue大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫。
　　數(shù)據(jù)庫中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。
為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱？
　　一般細(xì)胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)（它是人體血液中**重要的pH緩沖系統(tǒng)），大多數(shù)培養(yǎng)液用它來保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。
　　對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。
　　是不是采用其他pH緩沖系統(tǒng)就不需要二氧化碳培養(yǎng)箱了呢？人們發(fā)現(xiàn)由于空氣中的二氧化碳濃度很低，如果細(xì)胞不在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的HCO3-會被耗盡，這樣會影響細(xì)胞的正常生長。所以大部分動物細(xì)胞的培養(yǎng)，還是需要二氧化碳培養(yǎng)箱。
　　細(xì)胞培養(yǎng)液中常附加其他的pH緩沖系統(tǒng)，比如HEPES緩沖系統(tǒng)，來增加pH緩沖能力。HEPES在pH7.2-7.4之間有很強(qiáng)的緩沖能力，當(dāng)透氣的培養(yǎng)器皿被拿到二氧化碳培養(yǎng)箱外面的時候，由于空氣中二氧化碳濃度很低，培養(yǎng)液中碳酸鹽緩沖系統(tǒng)就會失去效果，這時候HEPES緩沖系統(tǒng)就能繼續(xù)保持pH的穩(wěn)定。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#

怎樣化凍動物細(xì)胞？ 
　　化凍過程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。
　　如果細(xì)胞儲存在液氮液面下，使用者**好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具（**少要戴上護(hù)目鏡，**好戴上面罩和較厚的手套），防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。
　　由于大多防凍劑與細(xì)胞長時間接觸時對細(xì)胞有毒害，所以**好盡快除去細(xì)胞凍存時加入的防凍劑。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
　　防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好 15-20ml 培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。
　　對于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。