方法二：磷酸鈣沉淀法
此法是研究基因轉(zhuǎn)染**先采用的技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，不需昂貴的轉(zhuǎn)染試劑，**今仍有研究者應(yīng)用此技術(shù)。其機(jī)制可能是DNA與磷酸鈣形成沉淀物，使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表，被細(xì)胞內(nèi)吞。但此法存在著不足的地方就是轉(zhuǎn)染效率比較低，有些細(xì)胞不能用此種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
l．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法
【材料】
(1) 2mol/l氯化鈣，0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。
(2) 2×HBS緩沖液：280mmol/L NaCI，10mmol/L KCl，1.5 mmol/L  Na₂HPO4，12mmol/L葡萄糖，50mmol/L  HEPES。
將1.6g NaCI，0.074g KCl，0.027g Na₂HP0₄·2H₂0，0.2g葡萄糖，1g HEPES溶于90ml水中，用0.5mol/L  NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，然后用雙蒸水定容**l00ml，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。
(3) 含15％甘油的1×HBS緩沖液。
(4) PBS緩沖液（pH7.4）。
【操作程序】
(1) 在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化，將1×10⁶個(gè)細(xì)胞接種于60mm的培養(yǎng)皿中，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(2) 在轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，按表13-2配制DNA-磷酸鈣共沉淀物
                 表13-2  DNA-磷酸鈣共沉淀物的制備

將質(zhì)粒DNA于0.263ml無菌水中，加入0.37μl 2mol/L氯化鈣溶液，混勻后，緩慢加入2×HBS緩沖液，并不斷輕輕搖振，緩沖液在30秒內(nèi)加完。將所配制的混和物在室溫靜置30分鐘。
(3) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基或PBS緩沖液洗滌一次，將DNA-磷酸鈣沉淀物加入培養(yǎng)皿中，在室溫下靜置20～30分鐘，然后再加入5ml培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(4) 培養(yǎng)24～48小時(shí)，可進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，或用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化克隆的篩選。
2．懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法
(1) 用離心法收獲1×10⁷個(gè)細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌一次細(xì)胞沉淀，再一次離心收獲細(xì)胞。
(2) 制備DNA-磷酸鈣沉淀物，方法同上。
(3) 用0.5ml DNA-磷酸鈣沉淀物重懸細(xì)胞沉淀，置室溫10～20分鐘。在細(xì)胞懸液中加入5ml完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(4) 培養(yǎng)16～24小時(shí)，收集細(xì)胞，棄轉(zhuǎn)染液，換以完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)或者克隆化篩選。
【注意事項(xiàng)】
(1) 在制備DNA-磷酸鈣沉淀物的靜置過程中，約5分鐘出現(xiàn)輕度混濁，濁度越來越深，大約在20～30分鐘時(shí)，在顯微鏡下觀察出現(xiàn)小顆粒。
(2) 顆粒的大小與轉(zhuǎn)染的效率密切相關(guān)，其判定方法是將試管對(duì)著光線觀察，見溶液呈混濁狀態(tài)，略帶白色，但肉眼又看不見顆粒，在高倍顯微鏡下則可見均勻細(xì)小的顆粒，此時(shí)的顆粒為比較理想的狀態(tài)。如果用肉眼即能看到顆粒，則說明所形成的顆粒太大；如果20分鐘后溶液仍然透明，則說明無顆粒形成或形成的顆粒太小。
(3) 在加入2×HBS時(shí)，一定要不斷的振搖，否則會(huì)形成大塊狀的顆粒。
(4) 在配制2×HBS緩沖液時(shí)，一定要注意溶液的pH，其可明顯地影響沉淀顆粒的形成。偏酸則不能形成顆粒，偏堿則形成的顆粒太大。這兩種情況均可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失敗。
(5) 在實(shí)際操作中，有的研究者為了增加轉(zhuǎn)染的效率，在轉(zhuǎn)染的(3)步驟后2～4小時(shí)進(jìn)行甘油休克。在實(shí)驗(yàn)前需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)該細(xì)胞對(duì)甘油的敏感性。方法是：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×10⁷個(gè)，棄培養(yǎng)基，加入0.5ml含15％甘油的1×HBS緩沖液。37℃溫育，分別在顯微鏡下觀察1、2、3分鐘時(shí)的細(xì)胞變化，如果在溫育過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓并死去，則轉(zhuǎn)染后勿進(jìn)行甘油休克。如果細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，才可進(jìn)行甘油休克。方法同細(xì)胞對(duì)甘油的敏感性檢測(cè)。甘油休克后，棄15％甘油的l×HBS緩沖液，用PBS洗一次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
(6) 另個(gè)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率的方法是用氯哇處理細(xì)胞。氯喹對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，一般在實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)決定合適的濃度。但對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來說，用濃度為l00μmol/L的氯喹處理或取得良好的效果。可在DNA-磷酸鈣沉淀物加入細(xì)胞之前或之后進(jìn)行，但需在甘油休克之前。處理后用PBS液清洗。在處理的過程中細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)泡狀變化，這是正常現(xiàn)象。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
方法三：電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)
電穿孔是指在高壓電脈沖的作用下使細(xì)胞膜上出現(xiàn)微小的孔，導(dǎo)致不同細(xì)胞之間的細(xì)胞膜發(fā)生融合。在后來的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電擊可以促使細(xì)胞通過微孔吸收外界環(huán)境中的DNA分子，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部。
【操作程序】
(1) 在10％胎牛血清DMEM的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)**50％～80％融合，收集細(xì)胞（0.5～1.0）×10⁷/ml，并用冰預(yù)冷的電穿孔緩沖液冼滌細(xì)胞2次。常用的電擊緩沖液有：PBS緩沖液（pH7.4），磷酸鹽蔗糖緩沖液（272nmol/L，7mmol/L磷酸鈉pH7.4，1mmol/L MgCl₂），Hamm’s Fl2培養(yǎng)基（不含小牛血清和抗生素）。
(2) 取0.8ml細(xì)胞懸液放人0.4cm的基因脈沖小池（gene pulser cuvette）中，取3～40μg質(zhì)粒加入細(xì)胞懸液中，充分混勻，冰浴10分鐘。
(3) 將基因脈沖小池放在電脈沖儀的正負(fù)極之間，電擊1次，電擊條件依據(jù)電擊緩沖液有所不同（表13-3）。
表13-3  所用的緩沖液及所需的電壓

 
(4) 電擊后將小池冰浴10分鐘。
(5) 從小池中吸出細(xì)胞，并用適量的培養(yǎng)墓稀釋細(xì)胞，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)或者克隆化篩選。
【注意事項(xiàng)】
(1) 電擊的**大電壓和電擊持續(xù)時(shí)間是影響轉(zhuǎn)染效率的2個(gè)主要因素。電擊電壓太小和／或持續(xù)時(shí)間太短，則轉(zhuǎn)染效率太低；如果電擊成壓太大和／或電擊時(shí)間太長(zhǎng)，細(xì)胞將不能存活，所以用此種方法轉(zhuǎn)染為了取得好的轉(zhuǎn)染效率，須進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索出**佳的電擊電壓和電擊持續(xù)時(shí)間。
(2) 細(xì)胞處于有絲分裂期時(shí)比較易感染外源DNA，所以在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞**好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
(3) 質(zhì)粒DNA的狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)染的影響。要使外源DNA整合到細(xì)胞染色體上，**好用線性DNA（因?yàn)榫€性DNA有較高的重組幾率）。瞬時(shí)表達(dá)用環(huán)狀的DNA即可。
(4) 質(zhì)粒DNA的濃度在2～40μg/ml范圍內(nèi)時(shí)，隨著DNA的濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率隨著增加。作為穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，DNA的濃度為2～10μg/ml，而某些瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)則需20～40μg/ml。
基因?qū)氲姆椒ㄟ€有DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)、基因顯微注射和納米級(jí)分子級(jí)顆粒的非脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑等方法。DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染的方法一般用于基因瞬時(shí)表達(dá)，它不易形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。基因顯微注射需要特殊的儀器和設(shè)備，操作比較復(fù)雜，但這種方法是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型以研究外源基因在整體動(dòng)物中表達(dá)調(diào)控規(guī)律的**好方法。同時(shí)可以改變動(dòng)物的基因型，更符合人類的需要，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生人類所需的生物活性物質(zhì)。納米級(jí)分子級(jí)顆粒的非脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑是一種不含脂類分子、內(nèi)毒素及任何動(dòng)物來源的成分，當(dāng)它與DNA混合時(shí)，形成納米大小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，這種技術(shù)由于不含脂類分子，所以特別適用于研究脂類分子的實(shí)驗(yàn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究及制藥公司藥物篩選。
篩選細(xì)胞克隆：
基因轉(zhuǎn)染人細(xì)胞后，有些細(xì)胞克隆所轉(zhuǎn)染的基因是高表達(dá)，而有些克隆是低表達(dá)。有些研究需要對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克降進(jìn)行篩選。一般需要2個(gè)過程，一是藥物篩選，二是克隆細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增。
1．藥物篩選  在基因?qū)诉^程中只有一小部分細(xì)胞獲得了外源性的DNA，穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因組DNA中，并且表達(dá)產(chǎn)物。為了有效、方便地鑒定出這些細(xì)胞來，一般在載體上具有一個(gè)能在這些細(xì)胞中產(chǎn)生可選擇性變化的顯性遺傳標(biāo)志。目前常用的這種標(biāo)志有胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neo）。表13- 4列出了這些標(biāo)記所適用的細(xì)胞和所用的篩選藥物。
             表13-4  標(biāo)記基因所適用的細(xì)胞和所用的篩選藥物

 
氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測(cè)系統(tǒng)不需加入篩選藥物，但需在制備的細(xì)胞提取物中加入檢測(cè)試劑乙酰輔酶A和¹⁴C標(biāo)記的氯酶素進(jìn)行孵育，薄層層析后通過放射自顯影測(cè)定產(chǎn)物。所以此法常用來分析啟動(dòng)子活性、表達(dá)產(chǎn)物的量等，一般用在瞬時(shí)表達(dá)研究。其他3種用來研究穩(wěn)定基因表達(dá)，**常用的是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因標(biāo)記系統(tǒng)。下面介紹的是G418篩選的方法。
【操作程序】
(1) 取l00mg G418溶于2ml去離子水中（濃度為50mg/m1），0.22μm微孔濾器過濾除菌，-20'C保存。
(2) 轉(zhuǎn)染后經(jīng)過48～72小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合時(shí)按1︰4傳代。
(3) 繼續(xù)培養(yǎng)**細(xì)胞達(dá)50%～70%融合。
(4) 棄去培養(yǎng)液，更換含有800μg/ml的G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選（其濃度可依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，不同的細(xì)胞對(duì)G418有不同的適合濃度），與此同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照進(jìn)行。
(5) 當(dāng)大部分細(xì)胞死亡時(shí)（約3～5天后，在鏡下觀察，細(xì)胞不再貼壁，漂浮起來，細(xì)胞變圓） ，再換一次液，G418濃度可降**150～250μg/ml，以維持篩選作用。
(6) 約10～20天后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸長(zhǎng)大后，將其轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增。
2．克隆細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增
將所形成的克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的方法常用的有兩種方法。
方法一：胰酶–濾紙粘附
【操作程序】
(1) 將所形成的克隆在顯微鏡下準(zhǔn)確標(biāo)記位置。
(2) 在超凈臺(tái)內(nèi)，吸去培養(yǎng)基，并用無血清的培養(yǎng)基洗滌兩次。
(3) 用無菌鑷夾取一塊約5mm方形滅菌3MM濾紙，用0.25％胰酶浸濕，置于克隆所標(biāo)記的位置處，5～20秒。
(4) 將24孔培養(yǎng)板每孔加入含有250μg/ml G418的選擇性培養(yǎng)基2ml，用鑷子取出粘附有克隆細(xì)胞的濾紙塊，置于24孔培養(yǎng)基中，涮洗數(shù)次，以使濾紙上粘附的細(xì)胞脫下。
(5) 將移有克隆細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(6) 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，胰酶消化后，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。
方法二：胰酶–Tip頭吸取
(1) 細(xì)胞克隆位置的確定和處理同上(1)和(2)。
(2) 用微量移液29（帶無菌Tip頭）吸取2～5μg 0.25%胰酶滴在細(xì)胞克隆位置上，并反復(fù)吹打數(shù)次，吸取液體。
(3) 將含有細(xì)胞的胰酶液體含有加入250μg/ml G418的選擇性培養(yǎng)基2ml 24孔板中。37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(4) 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，胰酶消化后，作進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)、鑒定。
上述列出了一些常用的基因?qū)朔椒ǎ浣Y(jié)果是否有效地轉(zhuǎn)染，除了用藥物抗性篩選標(biāo)志外，還需對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步鑒定，所用的方法就是應(yīng)用細(xì)胞的分離提取研究，提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和Northern blot檢測(cè)，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測(cè)。另外還有下面將要介紹的原位檢測(cè)。
 
三、 原位檢測(cè)研究
 
對(duì)有些很難大量培養(yǎng)細(xì)胞的基因和其產(chǎn)物檢驗(yàn)和鑒定，很難用提取蛋白質(zhì)和核酸的方法進(jìn)行，需要用靈敏度比較高的原位檢測(cè)的方法。根據(jù)檢測(cè)的對(duì)象可以分為兩類，一是蛋白質(zhì)檢測(cè)，應(yīng)用原理是抗體與抗原的特異結(jié)合，它不但反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量，還可以反應(yīng)蛋白質(zhì)所處位置；二是核酸檢測(cè)，應(yīng)用原理是用標(biāo)記好的核酸探針與細(xì)胞巾的核酸分子進(jìn)行雜交反應(yīng)。
1．蛋白質(zhì)檢測(cè)  此種方法根據(jù)二抗的類型，可以分為化學(xué)檢測(cè)和熒光檢測(cè)，由于熒光檢測(cè)的靈敏度比較高，而且也比較方便、簡(jiǎn)便，所以現(xiàn)較多采用。下面介紹的就是免疫熒光檢測(cè)。
【操作程序】
(1) 取干凈蓋玻片，放人75％乙醇浸泡1小時(shí)，取出玻片在酒精燈上烤干，用DMEM培養(yǎng)基漂洗數(shù)次，放人細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將傳代的細(xì)胞傳人該皿。
(2) 待蓋玻片上長(zhǎng)滿細(xì)胞后，取出玻片用PBS緩沖液洗2～3次，，空氣干燥（一定要干燥）。
(3) 將蓋玻片浸入-20℃預(yù)冷的丙酮內(nèi)，于-20℃固定30分鐘，PBS緩沖液洗3次，空氣晾干（必須要于燥）。
(4) 在parofilm膜上滴加**抗體，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在抗體上，密封于37℃濕盒中孵育30分鐘～1小時(shí)。
(5) PBS液洗3～6次，空氣中晾干。
(6) 加熒光素標(biāo)記的第二抗體在parafilm膜上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在抗體上，放入濕盒中，于37℃孵育30分鐘～1小時(shí)。
(7) PBS液洗3～6次，空氣中晾干。
(8) 用60％的甘油將蓋玻片封在載玻上在熒光顯微鏡下觀察。
【注意事項(xiàng)】
(1) 細(xì)胞的處理可以在收獲后涂片在載玻片上，進(jìn)行丙酮固定；加抗體于載玻片上，可用蓋玻片蓋住抗體進(jìn)行反應(yīng)。
(2) 所加抗體的量要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，第二抗體在用時(shí)一般需進(jìn)行稀釋，—般以1︰100～1000為宜。
(3) 免疫熒光檢測(cè)靈敏度高、簡(jiǎn)便，但有時(shí)有較多的非特異性熒光顆粒，所以—定要做陰性對(duì)照，可以將**抗體換為其他的無關(guān)抗體。
(4) 由于熒光素在自然光下易于褪色，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)立即觀察，若要保存可將玻片包在黑紙內(nèi)，置4℃冰箱可保存一周。
(5) 這種熒光檢測(cè)的方法，有時(shí)熒光素標(biāo)記在**抗體上，則可不用第二抗體，成之為直接免疫熒光檢測(cè)，此時(shí)可以使實(shí)驗(yàn)的時(shí)間縮短，又可以明顯降低非特異反應(yīng)。上述介紹的是間接熒光免疫檢測(cè)。
2．核酸檢測(cè)  這種核酸檢測(cè)亦稱之為細(xì)胞核酸原位雜交，其基本原理是利用核酸分子的堿基序列配對(duì)的互補(bǔ)性（A：T，A：U，G：C），將已知的有標(biāo)記的外源核酸分子（探針）與細(xì)胞標(biāo)體內(nèi)的RNA或DNA進(jìn)行雜交，經(jīng)過放射自顯影或酶的催化反應(yīng)顯示其在細(xì)胞的位置。細(xì)胞原位雜交技術(shù)近年束發(fā)展非常迅速，尤其在發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)及腫瘤學(xué)等*域中應(yīng)用廣泛。探針的標(biāo)記技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)也不斷地更新。由放射性探針到目前許多非放射性探針，如生物素蛋白–AP（堿性磷酸酶）、地高辛–AP和地高辛–HRP（辣根過氧化物酶）等檢測(cè)系統(tǒng)。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否能夠直接被檢測(cè)，原位雜交技術(shù)可以分為直接法和間接法兩種。為了提高檢測(cè)技術(shù)的敏感度，將PCR技術(shù)與原位雜交結(jié)合起來，大大提高了檢測(cè)效率。下面主要介紹培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交地高辛–堿性磷酸酶檢測(cè)技術(shù)。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
【操作程序】
(1) 細(xì)胞片的制備：
1) 將蓋玻片上生長(zhǎng)的細(xì)胞用PBS液洗滌3次，空氣中干燥。亦可取細(xì)胞培養(yǎng)瓶中胰酶消化的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，涂片到載玻片上；對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞將細(xì)胞涂片**載玻片上，此時(shí)所用的載玻片要預(yù)先涂有多聚賴氨酸。
2) 用1︰1的甲醇：丙酮或4％的多聚甲醛固定10～30分鐘。
3) 0.2moL HCl室溫作用10分鐘，0.1％～0.3％TritonX-100作用15分鐘。
4) 含0.2％的甘氨酸的PBS液于室溫孵育15分鐘。
5) 1μg/ml蛋白酶K（0.1mo/L Tris-Cl，50mmol/L EDTA，pH8.0 配制） 37℃濕盒中消化10～30分鐘。
6) 含0.2％甘氨酸的PBS液于室溫孵育15分鐘。
7)  PBS-5mmol/L MgCl₂洗2次，每次10分鐘。
8)  4％的多聚甲醛固定15分鐘。
9)  PBS-5mmol/L MgCl₂洗2次，每次10分鐘。
10) 逐級(jí)酒精脫水（70％、80％、90％、95％、100％各5分鐘），空氣中干燥。
(2) 預(yù)雜交和雜交：
1) 將玻片浸入2×SSC中15分鐘。
2) 再用50％去離子甲酰胺（4×SSC與甲酰胺等體積配制）37℃孵育15分鐘。
3) 加預(yù)雜交液20μl/片42℃孵育30分鐘～1小時(shí)。試劑盒中有此試劑，亦可自行配制，50％去離子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt’s液，2％SDS，100μg/ml變性的鮭魚精DNA。
4) 去除預(yù)雜交液，每片加20μl雜交液（含0.2 ～520μg/ml探針），用硅化過的蓋玻片覆蓋，石蠟封住蓋玻片的四周，42℃濕盒中孵育12～18小時(shí)。
5) 去除石蠟，小心移去蓋玻片（可以在2×SSC浸泡，讓其自行脫落），用2×SSC洗2分鐘。
6) 在含20μg/ml RNase的2×SSC溶液中于37℃浸泡30分鐘 （此步針對(duì)RNA探針，對(duì)于DNA探針省略）。
7) 2×SSC 42℃洗滌，10分鐘，2次。
8) 0.1×SSC 42℃洗滌2次，每次30分鐘，
(3) 雜交檢測(cè)：
在進(jìn)行檢測(cè)前需配制下列緩沖液。緩沖液I：順丁烯二酸（馬來酸）0.1mol/L，NaCl0.15mol/L，用NaOH將pH調(diào)**7.5（20 ℃），高壓滅菌。
緩沖液Ⅱ：將阻斷劑溶于緩沖液I中**終深度為10％（W/V），加熱溶解，高壓消毒。用水10倍稀釋即成緩沖液Ⅱ。
緩沖液Ⅲ（pH9.5，20℃）：Tris-Cl 100mmol/L，NaCl l00mmol/L，MgCl₂ 50mmol/L。
TE緩沖液：Tris-Cl 100mmol/L，EDTA 1mmol/L。
顯色液：取45μl NBT（硝基四氮唑藍(lán)），35μl X-phosphate-solution（5溴-4氯-3吲哚磷酸，BCIP），加10ml緩沖液Ⅲ混和而成（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
【操作程序】
1) 將玻片用緩沖液I洗滌，室溫，2分鐘。
2) 將玻片用緩沖液Ⅱ洗滌，室溫，30分鐘，不斷振搖。
3) 用緩沖液Ⅱ?qū)⒌馗咝量贵w–堿性磷酸酶1︰5000稀釋，將玻片浸入此溶液中1～2小時(shí)。
4) 緩沖液I洗滌，室溫，15分鐘，2次。
5) 緩沖液Ⅲ洗滌，室溫，3分鐘。
6) 將玻片浸入顯色液中，室溫，避光顯色，16小時(shí)（在顯色過程中，不要晃動(dòng)液體）。
7) TE緩沖液洗滌，室溫，2分鐘。
8) 用親水性封片劑封片，顯微鏡下觀察。陽性反應(yīng)呈深藍(lán)色。
綜上所述，本節(jié)詳細(xì)描述了細(xì)胞培養(yǎng)過程小的分子生物學(xué)研究操作步驟。如前所述，任何基因的功能，都需要通過細(xì)胞內(nèi)的過程加以研究和檢測(cè)，因而細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是分子生物學(xué)的不可缺少的一個(gè)重要部分。
 
第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)在生物工程中的應(yīng)用
 
生物工程是指用生物體或其組成成分自**適條件下生產(chǎn)有益產(chǎn)物或進(jìn)行有效過程的技術(shù)它所包含的內(nèi)容有主要有基因工程、酶工程、發(fā)酵工程、細(xì)胞工程、生化工程等。近年來把細(xì)胞的大量培養(yǎng)亦列為細(xì)胞工程的內(nèi)容。在這些內(nèi)容中與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的主要是細(xì)胞工程。
細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要方面。總的來說，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。當(dāng)前細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)*域有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體操作及基因轉(zhuǎn)移等方面。通過細(xì)胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價(jià)值的細(xì)胞株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。
細(xì)胞工程已經(jīng)滲透到人類生活的許多*域，取得了許多具有開發(fā)性的研究成果，有的已在生產(chǎn)中推廣，收到了明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。隨細(xì)胞工程技術(shù)研究的不斷深入，它的前景和產(chǎn)生的影響將會(huì)日益地顯示出來。
根據(jù)設(shè)計(jì)要求，按照需要改造遺傳物質(zhì)的不同操作層次，可將細(xì)胞工程學(xué)分為染色體工程、染色體組工程、細(xì)胞質(zhì)工程和細(xì)胞融合工程等幾個(gè)方面。
1．染色體工程   染色體工程是按人們需要來添加、削減或者替換同源或異源染色體或其中的某一部分的方法技術(shù)。可分為動(dòng)物染色體工程和植物染色體工程兩種。動(dòng)物染色體工程主要采用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行微操作的方法（如微細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法等），來達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。植物細(xì)胞工程目前主要是利用傳統(tǒng)的雜交回交等方法來達(dá)到添加、消除或置換染色體的目的。
2．染色體組工程   染色體組工程是按照人們的設(shè)計(jì)，削減或添加同種或異種染色體組，以改變生物遺傳物質(zhì)的技術(shù)和方法。經(jīng)過這種遺傳物質(zhì)改造的物種，會(huì)符合人們的需要，如四倍體水稻的稻粒比二倍體的明顯大，蛋白質(zhì)的含量可提高5％～50％。但這項(xiàng)技術(shù)一般應(yīng)用在植物上。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
3．細(xì)胞質(zhì)工程   又稱細(xì)胞拆臺(tái)工程，按照人們的沒想，運(yùn)用物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（或細(xì)胞器，如線粒體）分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞。可用于研究細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)關(guān)系的基礎(chǔ)研究和育種工作。克隆羊“多莉”就是一個(gè)很好的例子，此項(xiàng)技術(shù)又稱核移植技術(shù)。
4．細(xì)胞融合工程   是用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過程。可用于產(chǎn)生新的物種或品系（植物上用得多，動(dòng)物上用得少）及產(chǎn)生單克隆抗體等。其中單克隆抗體技術(shù)，利用克隆化的雜交瘤細(xì)胞分泌高度純一的單克隆抗體，具有很高的實(shí)用價(jià)值，在診斷和治療病癥方面有著廣泛的應(yīng)用前途（此項(xiàng)內(nèi)容在細(xì)胞培養(yǎng)生物制品的應(yīng)用中有介紹）。另外細(xì)胞融合也應(yīng)用在基因功能和尋找致病基因的研究中，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞與人淋巴細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞總是保留著小鼠完整染色體組型，而僅有一條**數(shù)條人染色體。根據(jù)染色體分析技術(shù)對(duì)雜種細(xì)胞及親本瘤細(xì)胞生物功能（如酶譜等）分析，說明是由于人染色體整合到瘤細(xì)胞染色體中所引起的。同時(shí)細(xì)胞融合技術(shù)也可用于分析癌基因在染色體中所處的位置，目前已知腫瘤基因可誘發(fā)腫瘤，采用細(xì)胞融合及染色體分子技術(shù)測(cè)定細(xì)胞致癌染色體，即可判斷致癌基因在染色體上所處位置。因此，細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)研究染色體結(jié)構(gòu)，闡明生物變異及腫瘤發(fā)生與發(fā)展機(jī)制有一定指導(dǎo)意義。
細(xì)胞培養(yǎng)除了在細(xì)胞工程應(yīng)用**多之外，在酶工程中亦有應(yīng)用，即將細(xì)胞限制在特定的空間位置，與酶同樣起到生物催化劑的作用。此項(xiàng)技術(shù)稱之為固定化細(xì)胞技術(shù)。這種技術(shù)由細(xì)菌已經(jīng)擴(kuò)展到動(dòng)物細(xì)胞，甚**到細(xì)胞器，如線粒體、微粒體等。
大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程的一個(gè)內(nèi)容，指在人工條件下，搞密度大量培養(yǎng)有用動(dòng)物細(xì)胞，生產(chǎn)有應(yīng)用價(jià)值的細(xì)胞產(chǎn)品的技術(shù)，如疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、皰疹病壽I型及Ⅱ型疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗等）、蛋白質(zhì)因子（凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素、IL-2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等）、免疫調(diào)節(jié)劑（α、β、γ干擾素）及單克隆抗體等；也是生物工業(yè)中大量增殖新型有用細(xì)胞不可缺少的技術(shù)，一些培養(yǎng)細(xì)胞可用于治療，如劉書欽等建立和應(yīng)用大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)獲得了移植人的CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞），具有抗人肺鱗狀癌腫SQ-5能力，保存3個(gè)月以后仍保持很高殺傷活性，達(dá)95％以上。在本節(jié)中主要介紹細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
當(dāng)人們認(rèn)識(shí)到利用細(xì)胞培養(yǎng)可以產(chǎn)生激素、疫苗、單克隆抗體時(shí)，而且對(duì)它們的需要量急劇增加，細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)運(yùn)而生了。開始是單靠增加容器的體積和數(shù)量來解決細(xì)胞產(chǎn)量的問題，隨著對(duì)動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的認(rèn)識(shí)和培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，使得動(dòng)物細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)成為現(xiàn)實(shí)并逐漸成熟，目前在生產(chǎn)規(guī)模上已經(jīng)達(dá)到10 000L。
 
 一、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的體系參數(shù)
    
動(dòng)物細(xì)胞的大量培養(yǎng)與小規(guī)模培養(yǎng)（培養(yǎng)容量小于2L）相比，條件更嚴(yán)格，控制難度更大，但培養(yǎng)的條件有些與小量培養(yǎng)是一致的。常用的參數(shù)有：選用的培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基，對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，為使其細(xì)胞不致凝集、成團(tuán)或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加Ca²⁺和Mg²⁺。加入一些非營(yíng)養(yǎng)性的培養(yǎng)液補(bǔ)充物，如0.11％的羥甲基纖維鈉，它可以減輕在培養(yǎng)過程中由于機(jī)器的攪拌造成對(duì)細(xì)胞的剪切損傷。0.11％的pluronic F–68，它可以減少在通氣和攪拌過程中所產(chǎn)生的氣泡。一些特殊的細(xì)胞需加入一些營(yíng)養(yǎng)因子，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞硒酸鹽等。細(xì)胞培養(yǎng)溫度足37℃，在細(xì)胞接種前培養(yǎng)液需預(yù)溫**37℃。細(xì)胞的接種密度為（5～20）×10⁴個(gè)/ml。攪拌速率依據(jù)培養(yǎng)容器和細(xì)胞的培養(yǎng)方式?jīng)Q定，一般對(duì)懸浮細(xì)胞可用100～500rpm，而微載體系統(tǒng)20～100rpm。pH一般控制在7.4，但有些細(xì)胞偏好在7.0，如雜交瘤，但不能低于6.8，否則將抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。pH的穩(wěn)定維持一般是依靠CO₂-NaHCO₃系統(tǒng)，采用通入5％CO₂無菌空氣的方式。260～320mOsm/kg的滲透壓對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說是適宜的。在培養(yǎng)過程需補(bǔ)充足夠的氧氣（一般是通無菌空氣），氧氣供給是細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一個(gè)限制因素。氧化還原電位適用于大多數(shù)細(xì)胞的值是+75～l00mv左右。在培養(yǎng)過程中，還要補(bǔ)充一些成分，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、谷氨酰胺等。
 
 二、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的工藝類型
 
無論呈懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞還是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，按操作方式，將工藝類型可以分為以下四種：
1．分批式培養(yǎng)   星指將細(xì)胞和培養(yǎng)物一次性加入培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)，在細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成同時(shí)進(jìn)行，經(jīng)過一段剛司反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)體系取出。這種培養(yǎng)方式，細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境處在不斷變化之中，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，乳酸等代謝抑制物增加，不能使細(xì)胞處在一個(gè)**優(yōu)化的條件下，因此在應(yīng)用過程中受到一定的限制。
2．流加式培養(yǎng)   針對(duì)分批式培養(yǎng)的缺點(diǎn)，在反應(yīng)過程中不斷加入新鮮的培養(yǎng)液，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖和生成產(chǎn)物，直到反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)體系。它可以避免細(xì)胞在代謝過程中的產(chǎn)物以及某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏對(duì)細(xì)胞的抑制作用。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
3．半連續(xù)式培養(yǎng)   也稱反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)過程中，不斷取出培養(yǎng)物，每次補(bǔ)充以新的培養(yǎng)液，再進(jìn)行分批式操作。它與流加式培養(yǎng)的區(qū)別是，流加式培養(yǎng)的體積是不斷增加，而半連續(xù)培養(yǎng)的體積是保持不變的。
4．連續(xù)式培養(yǎng)   是指將細(xì)胞和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器后，采用灌注培養(yǎng)法，連續(xù)排出用過的培養(yǎng)基，與此同時(shí)連續(xù)地加入新鮮的培養(yǎng)液，一般不輸出細(xì)胞，使細(xì)胞在一個(gè)恒定、優(yōu)化的環(huán)境下生長(zhǎng)和生成產(chǎn)物，但細(xì)胞在數(shù)量有波動(dòng)。如果同時(shí)取出與培養(yǎng)液等量的細(xì)胞則稱為連續(xù)–流動(dòng)式培養(yǎng)，它是在真正內(nèi)環(huán)境上保持穩(wěn)定，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞數(shù)量不存在波動(dòng)。這種方法適用于懸浮細(xì)胞和在微載體上生長(zhǎng)的細(xì)胞。
在這些工藝中，以連續(xù)培養(yǎng)為**佳類型，因?yàn)橄到y(tǒng)優(yōu)化的環(huán)境符合細(xì)胞的生理和代謝規(guī)律，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和生成產(chǎn)物，但也有些缺點(diǎn)，如培養(yǎng)基的消耗量大，操作過程復(fù)雜，增加了污染機(jī)會(huì)等。
 
三、 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法
    
培養(yǎng)方法比較多，大致可以分為懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)法。
1．細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法  細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法稱之為懸浮培養(yǎng)法。適用于培養(yǎng)細(xì)胞株、腫瘤細(xì)胞、血液細(xì)胞及淋巴組織細(xì)胞，用于大量生產(chǎn)疫苗、α–干擾素、白介素及McAb（單克隆抗體）等藥品。但此法不適用于少數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和人二倍體細(xì)胞（WI-38、MRC-5），這些細(xì)胞在這種條件下培養(yǎng)則完全不能生存。一些原本貼壁生長(zhǎng)但具有懸浮培養(yǎng)潛能的細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)和選擇后，可以應(yīng)用此種體系進(jìn)行培養(yǎng)，如由L929細(xì)胞誘導(dǎo)出的LS細(xì)胞系，由HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)出的HeLa-S3細(xì)胞等。
此種體系明顯的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)的體積大、成本低，可連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行移植傳代培養(yǎng)，傳代時(shí)無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機(jī)械損害。細(xì)胞處于均勻一致的培養(yǎng)基中，因此可以獲得穩(wěn)定狀態(tài)，并且容易放大。細(xì)胞回收率高，并可連續(xù)測(cè)定細(xì)胞濃度，還有可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。
為了確保細(xì)胞在培養(yǎng)過程中呈單顆粒、均勻懸浮狀態(tài)，在培養(yǎng)系統(tǒng)中使不同的培養(yǎng)相之間（生物學(xué)的、液體的、氣體的）保持合適的物質(zhì)轉(zhuǎn)移率，以及便利散發(fā)系統(tǒng)產(chǎn)生的熱量，需采用通氣攪拌或空氣提升式（常簡(jiǎn)稱氣升式）生物反應(yīng)器。
通氣攪拌生物反應(yīng)器，其裝置中的攪拌器（圖13-l所示）具有籠式的通氣腔和消泡腔。氣液交換在由200目（75μm）不銹鋼絲網(wǎng)制成的通氣腔內(nèi)進(jìn)行，在通氣過程中所產(chǎn)生的氣泡經(jīng)管
道進(jìn)入液面上部的消泡腔內(nèi)，氣泡碰到鋼絲網(wǎng)，破裂分為氣體和液體兩部分，從而達(dá)到了深部通氣和避免產(chǎn)生氣泡的目的。
 
 
  
氣升式生物反應(yīng)器（圖13-2），是依據(jù)氣泡柱的原理設(shè)計(jì)的，氣體混和物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器，產(chǎn)生的氣泡進(jìn)人中央引流管，此時(shí)管內(nèi)的培養(yǎng)液的密度將小于外周的培養(yǎng)液，推動(dòng)著中央管中的培養(yǎng)液上升，從中央管流出的培養(yǎng)液向下循環(huán)到容器的外側(cè)，從而形成一個(gè)循環(huán)，這樣產(chǎn)生混勻作用（氣泡代替機(jī)械攪拌細(xì)胞），與此同時(shí)進(jìn)行供氧。這種反應(yīng)器有2種類型，內(nèi)循環(huán)式和外循環(huán)式，一般采用的是內(nèi)循環(huán)式，也有采用外循環(huán)式。目前10 000L的氣升式反應(yīng)器已經(jīng)設(shè)汁成功并投入使用。圖13-3所示是1000L動(dòng)物細(xì)胞氣升式培養(yǎng)流程圖。體外懸浮液細(xì)胞密度一般在5×10⁶個(gè)/ml以下，要提高細(xì)胞產(chǎn)量，需擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模，規(guī)模越大則越難控制。
 
 
 
 
 
 
2．固定化培養(yǎng)法  將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱之為細(xì)胞固定化培養(yǎng)法。動(dòng)物細(xì)胞幾乎皆可采用固定化方法培養(yǎng)。固定化方法有吸附法和包埋法。
吸附法是**簡(jiǎn)單的固定化培養(yǎng)方法。細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠貼附在載體（如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒）的表面，或附著于中空纖維膜及培養(yǎng)容器表面。由于其負(fù)載能力不高，有時(shí)細(xì)胞會(huì)從載體表面脫落，不能達(dá)到保護(hù)細(xì) 胞的目的，同時(shí)細(xì)胞的擴(kuò)散沒有限制。
包埋法是將細(xì)胞包埋于多聚物（蛋白質(zhì)、碳?xì)浠衔铮┑群＞d狀基質(zhì)中的進(jìn)行培養(yǎng)方法。蛋白質(zhì)多聚物有明膠、膠原和纖維蛋白質(zhì)。明膠在30℃以上即融化，而細(xì)胞的**適生長(zhǎng)溫度是37℃，所以不能作為動(dòng)物細(xì)胞包埋的介質(zhì)。可溶性纖維蛋白原通過凝血作用后，生成不可溶性纖維蛋白，但機(jī)械穩(wěn)定性差。但如果這種轉(zhuǎn)化作用在兩相系統(tǒng)中完成，則機(jī)械強(qiáng)度增加，形成球形，此多聚物適合用于包埋貼壁依賴性生長(zhǎng)的細(xì)胞。碳?xì)浠衔锏亩嗑畚锟梢杂糜诎窦?xì)胞的有海藻酸鈉和瓊脂糖。海藻酸鈉與細(xì)胞混和后，當(dāng)加入一定濃度的氯化鈣時(shí)，能形成凝聚的小球，即不溶的海藻酸鈣，細(xì)胞即包埋在小球內(nèi)。這種方法可以用于包埋血細(xì)胞。**后用檸檬酸鈉或離心破碎聚合物，收獲細(xì)胞和產(chǎn)物。許多瓊脂糖都適用于動(dòng)物細(xì)胞的固定化，它需借助于石蠟油的作用形成小球體（80～ 200μm）。這種包埋方法**適合于懸浮細(xì)胞，被廣泛用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)在于，細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，可以獲得較高的生長(zhǎng)密度（（50～200）×10⁶個(gè)細(xì)胞/m1），細(xì)胞損傷程度低、培養(yǎng)的壽命長(zhǎng)，易于更換培養(yǎng)液，細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離，培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡(jiǎn)化了產(chǎn)品分離純化操作。
這種方法所采用的生物反應(yīng)器有螺旋卷膜培養(yǎng)器、多層托盤式培養(yǎng)器、中空纖維及流化床式培養(yǎng)器等（圖13-4）。后兩者具有工程化配套設(shè)備，已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。
 
 
 中空纖維培養(yǎng)器屬填充床式反應(yīng)器，反應(yīng)器內(nèi)的中空纖維，為細(xì)胞以組織樣生長(zhǎng)提供了復(fù)雜的脈管系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)胞灌人培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，纖維壁為細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)提供了巨大的表面積。這種反應(yīng)恭不但可以適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可以培養(yǎng)貼壁依賴生長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)密度可高達(dá)10⁸個(gè)/ml以上，如果控制得當(dāng)，不受污染，細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)數(shù)月，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。
流化床培養(yǎng)器是使支持細(xì)胞生長(zhǎng)的微粒呈流態(tài)化，微粒的大小約為500μm，而且具有多孔性。細(xì)胞接種于微粒中，反應(yīng)器的垂直向上的循環(huán)流動(dòng)使培養(yǎng)液成為流化床，在此過程中不斷地供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分和氧。培養(yǎng)液雖處流動(dòng)狀態(tài)，但對(duì)細(xì)胞不會(huì)造成剪切機(jī)械損傷。所以它具有培養(yǎng)的細(xì)胞密度高，可以長(zhǎng)期、連續(xù)培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
3．微載體培養(yǎng)方法  將細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)方法，稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。
動(dòng)物細(xì)胞貼附在微載體表面生長(zhǎng)與細(xì)胞表面及微載體表面的化學(xué)–物理性質(zhì)有關(guān)，微載體表面帶有正電荷，而細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，這種靜電吸引作用使細(xì)胞易于在微載體表面貼附，一些細(xì)胞分泌纖粘素和冷析球蛋白（兩者都是糖蛋白），起到細(xì)胞與載體表面的架橋作用，而溶液中的鈣、鎂離子等二價(jià)離子作為糖蛋白結(jié)合的媒介。
用于制備微載體的材料的理想條件是對(duì)細(xì)胞無毒，具有一定的親水性，易于貼附細(xì)胞，其密度要略大于培養(yǎng)液，在1.03～1.05之間，但不能大于1.1，能夠高壓滅菌、重復(fù)利用，載體的直徑在40～120μm范圍內(nèi)等。
目前已被選用的材料有交聯(lián)萄聚糖、DEAE-纖維、塑料基質(zhì)、玻璃介質(zhì)等，如表13-5列出常用的類型和特征。
                       表13-5  常用的微載體類型

 
上述微載體中，為了更好地吸附細(xì)胞，特別是一些體外培養(yǎng)貼壁比較困難的細(xì)胞，為了解決這個(gè)問題，Cytoder3是在交聯(lián)葡聚糖的表面上化學(xué)耦合了一層變性膠原。有的載體具有高正電荷的毒性效應(yīng)，為了降低此種反應(yīng)，可用火棉膠涂抹載體表面。目前研究者正在不斷地研制和開發(fā)新的載體，以滿足日益增加的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞制品的需要。
微載體培養(yǎng)這種模式兼有單層細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)。它依靠的是微載體的表面積/體積比較大的特點(diǎn)，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積，例如Cytodex 1干顆粒直徑為60～87μm，在培養(yǎng)液中可膨脹成160～230μm，每克微粒表面積約為0.6m²，相當(dāng)于7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)瓶（Φ285×110mm）或6塊多層托盤用的玻璃培養(yǎng)板表面積，細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)10⁵個(gè)/ml。通過增加培養(yǎng)罐體積即可達(dá)到擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的目的，而且培養(yǎng)基的利用率高，細(xì)胞較容易收獲，所占空間小，減少?gòu)S房及設(shè)備投資，節(jié)約動(dòng)力消耗及人力，又便于對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)與控制。由于以上優(yōu)點(diǎn)，貼壁依賴生長(zhǎng)的細(xì)胞大多采取這種方式。
常用于微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器是CelliGen罐，它是一種籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
 
第三節(jié)  細(xì)胞培養(yǎng)在生物制品中的應(yīng)用
 
一、生物制品的概念
    
目前認(rèn)為凡是從微生物、原蟲、動(dòng)物或人體材料制備或用現(xiàn)代生物技術(shù)、化學(xué)方法制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他疾病的制劑，通稱為生物制品。狹義的生物制品包括菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素和抗血清等。廣義的生物制品還包含抗生素、血液制劑、腫瘤以及免疫病等非傳染性疾病的制劑等。所采用的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，一般認(rèn)為主要包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程四個(gè)部分組成，但還有一些邊緣技術(shù)。其中細(xì)胞工程包括細(xì)胞培養(yǎng)和移植、細(xì)胞融合、動(dòng)物的胚胎工程、植物的微繁殖、單倍體育種、原生質(zhì)的培養(yǎng)和細(xì)胞雜交等。可見在生物制品學(xué)中，細(xì)胞培養(yǎng)是生物制品的一個(gè)主要的應(yīng)用技術(shù)。通過細(xì)胞培養(yǎng)所能獲得的生物制品主要有：?jiǎn)慰寺】贵w、病毒疫苗（狂犬病、乙型肝炎等）、生長(zhǎng)因子（表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子）、免疫調(diào)節(jié)劑（干擾素）、酶（組織血纖溶酶原激活劑）、細(xì)胞克隆等。本節(jié)主要介紹細(xì)胞培養(yǎng)在疫苗制備中的應(yīng)用。
 
二、細(xì)胞培養(yǎng)在疫苗制備中的應(yīng)用
    
生物制品中一大類就是疫苗，它包括細(xì)曲性疫苗、病毒性疫苗。其中病毒性疫苗的發(fā)展可分為三個(gè)時(shí)期。**，古典疫苗時(shí)期，在原體發(fā)現(xiàn)以前，根據(jù)反復(fù)觀察和摸索經(jīng)驗(yàn)而制出疫苗時(shí)期，古典疫苗只有牛痘苗和狂犬病疫苗，所采用的方法是以動(dòng)物制備或動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)。第二，病毒培養(yǎng)疫苗時(shí)期，即利用病毒培養(yǎng)技術(shù)制備疫苗時(shí)期，所制出的疫苗稱為傳統(tǒng)疫苗。此時(shí)所采用的技術(shù)是小鼠、雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，產(chǎn)生的疫苗有黃熱病、流感、乙型腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等疫苗。第三，基因工程疫苗時(shí)期，即依照生物工程技術(shù)研制而出的病毒亞單位疫苗時(shí)期．研制出來的這類新型疫苗就是基因工程疫苗，它采用了分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)等新技術(shù)，如乙型肝炎病毒疫苗。可以這樣認(rèn)為，動(dòng)物疫苗、雞胚疫苗、細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，是多種疫苗發(fā)展的三步曲，如狂犬病疫苗經(jīng)歷過動(dòng)物疫苗、雞胚疫苗，**后發(fā)展為細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。為比較動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)、基因工程疫苗的發(fā)展，將各種技術(shù)所制備的主要疫苗種類列入表13-6。
基因工程疫苗是現(xiàn)在疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，但有些疫苗仍不能通過這種方法進(jìn)行疫苗的制備。細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)比較可行、簡(jiǎn)單制備疫苗的策略。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)也是病毒研究工作中**主要的基礎(chǔ)之一。細(xì)胞培養(yǎng)使生物制品學(xué)有很大的發(fā)展，可以獲得純系病毒，給活疫苗選毒種提供了**佳條件。制備各種死活疫苗，尤其加工制備濃縮提純疫苗，大大提高了效力，減少了反應(yīng)，取代了許多用動(dòng)物或雞胚制備疫苗。近年發(fā)展起來的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、微載體細(xì)胞培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)，已經(jīng)走上了大批量、工業(yè)化、自動(dòng)化培養(yǎng)技術(shù)。
 
表13-6 各種技術(shù)所制備的主要疫苗

 
在疫苗制備上，細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)于動(dòng)物培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng)仍有許多得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)。
1．細(xì)胞沒有特異性的免疫力。細(xì)胞在離體組織培養(yǎng)后，不存在免疫作用，易被病毒感染。
2．病毒敏感范圍廣泛，有些病毒具有嚴(yán)格的宿主及組織特異性，但離體的細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)病毒的敏感范圍就比較廣泛。如脊髓灰質(zhì)炎病毒可以在非神經(jīng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，對(duì)原始人羊膜細(xì)胞不敏感，但在原代培養(yǎng)的羊膜細(xì)胞則敏感，并有細(xì)胞病變。腸道病毒、呼吸道鼻病毒等大都能在猴腎細(xì)胞培養(yǎng)上生長(zhǎng)。
3．在分離病毒時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)可大量接種標(biāo)本，從而增加了分離幾率。
4．提高了收獲物的純度，易于加工處理。
5．細(xì)胞培養(yǎng)瓶間的差異比較小，大大地提高廠實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。
目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞類型及所制備的疫苗類型如表13-7所示。
 
            #p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#表13-7  細(xì)胞培養(yǎng)制備疫苗所用的細(xì)胞類型和疫苗類型

 
下面以狂犬病疫苗的制備為例簡(jiǎn)單介紹苗的制備過程。
1．使用12g左右健康的金黃地鼠，無菌取腎，去除腎包膜、結(jié)締組織及血凝塊。
2．將腎皮質(zhì)切成1mm³大小的組織碎塊，丟棄髓質(zhì)部分。
3．用0.25％的胰酶消化組塊30分鐘。
4．離心收集細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液。
5．按常規(guī)培養(yǎng)，制成單層細(xì)胞。
6．接種病毒，用10L轉(zhuǎn)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，分兩階段進(jìn)行，37℃培養(yǎng)3天，于第4天收集病毒溶液；更換培養(yǎng)液，33℃繼續(xù)培養(yǎng)，3天后，收集病毒培養(yǎng)液。
7．進(jìn)行病毒毒力滴定試驗(yàn)，要求達(dá)到5LogLD₅₀/ml。
8．經(jīng)過0.45μm濾膜濾過，用分子量30萬超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后用1︰1000 ~ 1︰10 000的9-丙內(nèi)酯滅恬，滅活后的濃縮液經(jīng)過凝膠過濾柱層析及離子交換柱層析進(jìn)行兩步純化試驗(yàn)。
 
第四節(jié)   細(xì)胞培養(yǎng)在藥物開發(fā)中的應(yīng)用
    
人類的進(jìn)步可以說是與疾病不斷斗爭(zhēng)的過程，而藥物是用于頂防、診斷和治療疾病和按需要有效調(diào)節(jié)人體生理功能的重要物質(zhì)，是人類防病治病、提高人體健康水平的有力武器。所以科學(xué)家們利用各種技術(shù)研制開發(fā)治療疾病的藥品。尤其是現(xiàn)在，在藥物開發(fā)上有了很大進(jìn)步，如以基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程為主體的現(xiàn)代生物技術(shù)和組合化學(xué)技術(shù)，已經(jīng)成了藥物開發(fā)的一個(gè)技術(shù)支柱。正是由于這些技術(shù)的進(jìn)步，并應(yīng)用這些技術(shù)改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)，使得開發(fā)出的藥物具有高效、低副作用等優(yōu)點(diǎn)。
一個(gè)藥物的開發(fā)，包括以下幾個(gè)過程：疾病流行趨勢(shì)、市場(chǎng)需求、技術(shù)水平現(xiàn)狀等基本情況調(diào)查；開發(fā)項(xiàng)目立題論證，視制藥公司的人力、財(cái)力、設(shè)備等綜合實(shí)力而確定立項(xiàng)研究；開展包括篩選、合成、提取、發(fā)酵等創(chuàng)新藥物的研究；創(chuàng)新藥物理化性質(zhì)及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究，動(dòng)物篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)候選化合物；開展包括藥效藥理、一般藥理、一般毒性、特殊毒性、代謝、工藝與制劑研究等的新藥臨床前試驗(yàn)研究；開展包括I、Ⅱ、Ⅲ期試用的新藥臨床試驗(yàn)；申請(qǐng)承認(rèn)許可，新藥上市。調(diào)查結(jié)果表明，在20世紀(jì)90年代，一個(gè)新藥開發(fā)成功，需15年，臨床前期試驗(yàn)需要6.5年，I、Ⅱ、Ⅲ期臨床分別需要1.5年、2年、3.5年，美G食品與藥品管理局（FDA）審批需1.5年。一般有這樣的規(guī)律，在每5000 ~ 10 000個(gè)進(jìn)入臨床前期試驗(yàn)的化合物中，只有5個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，到**后只有1個(gè)獲得批準(zhǔn)上市，整個(gè)過程成奉需要花費(fèi)5億美元。由此可以看出，一個(gè)新藥的開發(fā)，是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)大、周期長(zhǎng)、高投入的過程。
在當(dāng)今世界，科技發(fā)展迅猛，在不斷探索新工藝、新方法、新設(shè)備來解決開發(fā)藥物中的周期長(zhǎng)、成本高的問題。由于有大量的化合物進(jìn)入臨床前期的藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥效學(xué)等研究和篩選。在這個(gè)篩選過程中，根據(jù)所選用的材料和藥物的作用對(duì)象以及操作特點(diǎn)，可將篩查模型分為三種：整體動(dòng)物水平、組織器官水平、細(xì)胞分子水平。目前得到廣泛應(yīng)用的就是細(xì)胞分子水平的藥物篩選模型。它與整體水平、器官組織水平的模型相比，細(xì)胞系的生物學(xué)特征較為一致，可用于觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生理特征的影響，從而判斷藥物療效及其毒性，具有材料用量少、藥物作用機(jī)制比較明確、可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選、縮短新藥篩選周期等特點(diǎn)。細(xì)胞分子水平藥物篩選模型的應(yīng)用為自動(dòng)化操作奠定了基礎(chǔ)，使藥物篩選由傳統(tǒng)手工篩選形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛捎?jì)算機(jī)控制的自動(dòng)化大規(guī)模篩選的新技術(shù)體系，形成了高通量藥物篩選（high throughut screening，HTS）。采用細(xì)胞分子水平篩選模型進(jìn)行藥物篩選，在兩方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)為，一是大樣本量的篩選，由于藥物篩選是對(duì)未知的探索和發(fā)現(xiàn)的過程，只有擴(kuò)大篩選對(duì)象和范圍，才能找到高質(zhì)量的藥物。二足實(shí)現(xiàn)了一藥多篩，由于這類藥物篩選模型所需樣品很少，可以使珍貴的藥物在多個(gè)模型進(jìn)行篩選，不但擴(kuò)大了新藥的范圍，而且有助于從老藥中發(fā)現(xiàn)新的用途。據(jù)報(bào)道，20世紀(jì)90年代初期，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)的方法，借助20余種藥物作用靶位，一年內(nèi)僅能篩選75 000個(gè)樣品；到了1997年HTS發(fā)展的初期，采用100余種靶位，每年可篩選1 000 000個(gè)樣品；而到1999年，由于HTS的進(jìn)一步完善，每天的篩選量就高達(dá)100 000種化合物，因而，稱之為超高通量篩選（ultrahieh-throughput screening）。這種新的飛躍，將大大加速新藥發(fā)現(xiàn)的速度。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步為高通量藥物篩選奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。這是組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在藥物開發(fā)應(yīng)用中的一層含義，另一層含義是利用細(xì)胞培養(yǎng)制出新的藥品，這一部分主要是指利用基因工程和細(xì)胞工程獲得（在前面有介紹）。在本節(jié)中主要介紹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在藥物篩選測(cè)試中的應(yīng)用。
培養(yǎng)的細(xì)胞可以用于藥物高通量篩選，但亦一些不足：①由于在體內(nèi)存在著許多因素可能對(duì)藥物進(jìn)行修飾，導(dǎo)致藥物作用的增強(qiáng)或減弱，由無致癌性轉(zhuǎn)變具有致癌性，所以在細(xì)胞培養(yǎng)條件所得的結(jié)果可能不一定就適用于體內(nèi)。②藥物對(duì)細(xì)胞的作用可以有多種表現(xiàn)，但由于檢測(cè)手段和檢測(cè)方法的限制，可供藥物篩選的指標(biāo)有限，所以在進(jìn)行測(cè)試時(shí)應(yīng)盡量取多種細(xì)胞類型，擴(kuò)大檢測(cè)范圍。
藥物測(cè)試的基本程序如下：
1．細(xì)胞選擇  利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行藥物測(cè)試時(shí)，shou先根據(jù)目的選擇合適的細(xì)胞類型，如果選擇的細(xì)胞不合適，則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性和參考價(jià)值。目前用于藥物開發(fā)測(cè)試研究的培養(yǎng)細(xì)胞主要來源于原代細(xì)胞、細(xì)胞系和細(xì)胞株，這三種細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)見表13-8。
                     表13-8  三種培養(yǎng)細(xì)胞的某些特征

   
從表中可以看出，這三種細(xì)胞有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在應(yīng)用時(shí)要根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。
如果在藥物效應(yīng)不明的情況下，對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的選擇可不必十分嚴(yán)格，但為了解藥物可能的作用，**好多選用幾種類型的細(xì)胞進(jìn)行。如已知藥物有特殊效應(yīng)的或欲求獲得對(duì)某一類細(xì)胞產(chǎn)生作用時(shí)，應(yīng)盡量采用相應(yīng)的細(xì)胞。如果是神經(jīng)系統(tǒng)藥物則用神經(jīng)細(xì)胞，抗癌藥物用癌細(xì)胞，如HeLa、KB、HL–60（人急性早幼粒白血病）、U937（人單核細(xì)胞白血病）、A-549（人肺腺癌）等，這樣獲得的結(jié)果才有參考價(jià)值。
對(duì)照細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)組合中不可少的組成部分。原則上實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞越相似越好。如檢測(cè)某一藥物用的是正常細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞可用同一細(xì)胞但不用藥物處理或僅用溶媒液處理即可。
2．藥物的溶解和保存  藥物在具體使用前一般都需配成貯存液，要根據(jù)藥物的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)娜軇绻撬苄裕纯捎貌煌耆囵B(yǎng)基或者PBS液配制100×母液，用時(shí)按所需濃度進(jìn)行稀釋。有些藥物不適宜水溶液配制的，可以用DMSO（二甲基亞砜）或無水乙醇進(jìn)行配制，要求要藥物工作濃度下，DMSO和乙醇的濃度要小于0.2％（V/V），這時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)照組要加入同等量的溶劑。所配制的母液根據(jù)藥物的性質(zhì)進(jìn)行保存，一般在-20℃．但有的藥物需放置于-70℃比較穩(wěn)定，一些光敏藥物還需避光保存。
3．藥物活化  運(yùn)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行藥物檢測(cè)有時(shí)并不能反應(yīng)體內(nèi)情況，確些藥物經(jīng)過肝臟后，會(huì)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化作用，如可能會(huì)使得原來沒有細(xì)胞毒性的藥物會(huì)產(chǎn)生毒性。為了彌補(bǔ)此缺陷，設(shè)計(jì)了一個(gè)與體內(nèi)環(huán)境比較相似的藥物活化試驗(yàn)，運(yùn)用大鼠或人的肝細(xì)胞恬檢材料和S9混和液在體外將藥物活化。受試藥物和S9混和液與細(xì)胞接觸作用時(shí)間一般為6小時(shí)。
4．藥物劑量  在試驗(yàn)開始前，需先確定待測(cè)藥物適用劑量。與利用動(dòng)物做試驗(yàn)一樣，先宜測(cè)出半效應(yīng)量（median infective dose，LD₅₀）。它的計(jì)算方法有兩種方法，一種是粗略估計(jì)法，另外是借用藥物的LD₅₀（半致死量）進(jìn)行精確計(jì)算。如果被測(cè)藥物是抗癌藥物或者是三致物（致畸、致突變、致癌）則兩者可等同。
粗略估計(jì)法：根據(jù)藥物的作用選擇合適的指標(biāo)進(jìn)行藥物的有效反應(yīng)性。例如檢測(cè)抗癌藥物殺細(xì)胞活性，如果其已在臨床應(yīng)用或做過動(dòng)物試驗(yàn)，此時(shí)可按已用藥量推算。在無據(jù)可依的情況下，只有按試驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)確定一組梯度數(shù)值，如11μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml然后安排一組培養(yǎng)細(xì)胞，共2瓶/組×5。分別向五組培養(yǎng)細(xì)胞中加入五個(gè)劑量的藥物，作用一定時(shí)間后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)試死活比數(shù)（存活的細(xì)胞可以排斥許多染料，如臺(tái)盼藍(lán)，細(xì)胞不著色，而死亡的細(xì)胞和嚴(yán)重受損細(xì)胞由于細(xì)胞膜的通透性改變，染料可通過細(xì)胞膜而被著色）。將所得數(shù)值進(jìn)行直線回歸，取50％死亡細(xì)胞時(shí)的濃度做為粗ID#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#₅₀。亦可用MTT的方法，設(shè)立一個(gè)對(duì)照組，不加入藥物，以此為100％的存活，取OD₅₇₀的值下降到50％的藥物濃度。這種方法在96板上即可完成，方便、簡(jiǎn)單，比較準(zhǔn)確。比較適用于貼壁細(xì)胞，如果足懸浮細(xì)胞，在操作過程中需要用到96孔板離心機(jī)。
借用計(jì)算LD₅₀一些常見的方法有：寇氏法（Karber’s method）、改良寇氏法和何爾恩法（Horn’s method）等，這些方法比較準(zhǔn)確。在計(jì)算過程有些復(fù)雜的運(yùn)算，為了解決這個(gè)問題，一些研究機(jī)構(gòu)開發(fā)出計(jì)算機(jī)軟件，使得計(jì)算更準(zhǔn)確和快速，如Bliss法。下面的計(jì)算公式是改良寇氏法：
LogID₅₀＝Xm－i （∑P－0.5）
i＝Log  （**大劑量／相鄰劑量）
∑P＝各組陽性反應(yīng)率之和
此法比較簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性也較高，但要求**大陽性反應(yīng)組的陽性率>80％，而且**小反應(yīng)陽性率不小于20％，否則要換用其他方法。
待ID₅₀確切值獲得后，取ID₅₀/10作為主要測(cè)試劑量。
5．藥物作用時(shí)間  確定出待測(cè)藥物的ID₅₀后，取ID₅₀/10為試驗(yàn)劑量。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性進(jìn)行加藥。如原代培養(yǎng)的細(xì)胞或收獲的貼壁細(xì)胞（經(jīng)胰酶消化過）一般要等到**少12小時(shí)以后，此時(shí)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性恢復(fù)到非胰酶水平。一般的**適宜時(shí)間是在接種后約第48小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，加藥后可再更換一次培養(yǎng)液，然后加入測(cè)試藥，置溫箱中培養(yǎng)。藥物在瓶皿中于細(xì)胞接觸時(shí)間要依據(jù)藥物的性質(zhì)（如半衰期）和細(xì)胞的敏感性決定，在試驗(yàn)開始時(shí)，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，做出藥物的作用效應(yīng)和時(shí)間關(guān)系的曲線，依此進(jìn)行選擇適當(dāng)?shù)淖饔脮r(shí)間。一般不應(yīng)少于8小時(shí)，也可處理12～24小時(shí)或更長(zhǎng)些，然后棄掉含有藥物的營(yíng)養(yǎng)液，用不完全培養(yǎng)液洗1～2次，再補(bǔ)充新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
6．細(xì)胞的觀察  在試驗(yàn)開始后，每天或按一定時(shí)間間隔，取出1組培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察，從瓶皿中抽出蓋玻片做各種方法的染色觀察，瓶皿中余下細(xì)胞制成細(xì)胞懸液通過計(jì)數(shù)等手段檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。總之為檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生物效應(yīng)，可結(jié)合應(yīng)用各種技術(shù)方法，進(jìn)行有針對(duì)性的檢測(cè)。
通過一些觀測(cè)指標(biāo)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，才能了解藥物對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)如何。各種藥物對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)各不相同，必須選擇相應(yīng)的指標(biāo)。下面列出了一些常用的檢測(cè)指標(biāo)。
(1) 細(xì)胞形態(tài)（光鏡下）：殺傷性藥物作用細(xì)胞后，可能有多方面反應(yīng)，一是細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)變化，在顯微鏡下容易判定，因此這項(xiàng)檢測(cè)可作為與臺(tái)盼藍(lán)檢查細(xì)胞同時(shí)并舉的指標(biāo)。有些細(xì)胞的形態(tài)是生長(zhǎng)的一個(gè)特征，如神經(jīng)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)，可以明顯地觀察到長(zhǎng)長(zhǎng)的軸突，當(dāng)用殺傷性藥物作用時(shí)，它的軸突會(huì)縮短。另一種是對(duì)細(xì)胞代謝和基因表達(dá)的變化。根據(jù)形態(tài)變化和生長(zhǎng)速率變化的結(jié)果，可大致分為以下5個(gè)等級(jí)：
0度：細(xì)胞在一定劑量一定時(shí)間藥物作用下，無任何反應(yīng)，細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)能力無改變，貼壁細(xì)胞緊貼瓶底，無脫落，細(xì)胞的折光性好，以（－）表示。
1度：細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞分裂指數(shù)下降，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，有少量貼壁細(xì)胞開始脫落，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒，以（+）表示。
2度：細(xì)胞生長(zhǎng)非常緩慢，細(xì)胞分裂指數(shù)顯著下降或近于消失，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)粗糙，部分細(xì)胞脫離瓶底，胞內(nèi)有顆粒堆積，以（++）表示。
3度：細(xì)胞生長(zhǎng)完全停止，分裂象消失，細(xì)胞回縮，相互間隙加大，細(xì)胞輪廓非常明顯，大部分細(xì)胞脫落，胞質(zhì)極度粗糙，內(nèi)充滿顆粒堆積，以（+++）表示。
4度：細(xì)胞全部脫落死亡，殘余的細(xì)胞亦瀕死或崩潰溶解，培養(yǎng)基的顏色顯示為堿性，以（++++）表示。
(2) 化學(xué)成分檢測(cè)：有的藥物對(duì)細(xì)胞功能的作用常表現(xiàn)在對(duì)某種物質(zhì)代謝產(chǎn)生抑制作用（如膠原），則以測(cè)試該成分在細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)液中的含量，即可感知藥物的效應(yīng)。對(duì)酶有作用時(shí)，可用組織化學(xué)方法或電泳等方法檢測(cè)。TorranceCJ等利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，開創(chuàng)了一類針對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)的新的策略，它的檢測(cè)速度快、自接，而且在缺少對(duì)照細(xì)胞的情況下也可進(jìn)行。作者將一具有K-ras基同突變的結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1，通過同源重組的方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊oK-ras突變的細(xì)胞系．將DLD-l轉(zhuǎn)染一種黃色熒光蛋白，而將缺失K–ras突變的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染有藍(lán)色熒光蛋白，二細(xì)胞系在不加任何抑制物共同培養(yǎng)時(shí)則生長(zhǎng)速度相同。研究者用此體系去篩選藥物，在藥物的作用下，如果黃色熒光增強(qiáng)，說明藥物抑制了缺失K-ras突變的細(xì)胞的生長(zhǎng)，如果藍(lán)色熒光增強(qiáng)，則說明藥物抑制了含K-ras突變的細(xì)胞的生長(zhǎng)。運(yùn)用這種方法，一共篩選了30 000個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)一個(gè)胞苷類似物在體外具有抑制含K-ras突變的細(xì)胞的生長(zhǎng)。
(3) 超微結(jié)構(gòu)的變化：細(xì)胞受藥物作用后，形態(tài)上很容易發(fā)生改變，如成纖維細(xì)胞突起回縮，上皮細(xì)胞相互分離變成梭形等，在一般光學(xué)顯微鏡下很容易看到，但這些變化十分不可靠，應(yīng)主要以超微結(jié)構(gòu)觀察到的改變?yōu)橐罁?jù)，如對(duì)細(xì)胞膜、微絨毛、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞核等微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。
(4) 細(xì)胞死亡檢測(cè)：致死效應(yīng)是藥物檢測(cè)中，特別是抗腫瘤藥的重要指標(biāo)。細(xì)胞死亡是一個(gè)很復(fù)雜的生命過程，shou先應(yīng)明確細(xì)胞死亡的概念。細(xì)胞崩潰、脫壁、溶解等是在顯微鏡下可觀察到的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，同樣也不能完全僅依靠這些為依據(jù)，否則一些不能迅速發(fā)生效應(yīng)的藥物作用易被忽視。應(yīng)該是凡能引起細(xì)胞內(nèi)相互制約系統(tǒng)中一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)的紊亂，**終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞生命活動(dòng)不可逆停止的現(xiàn)象，都應(yīng)視為細(xì)胞死亡的范疇。如氰化物抑制細(xì)胞氧化磷酸化阻斷ATP供應(yīng)，氯霉素干擾蛋白質(zhì)合成抑制細(xì)胞修復(fù)等，進(jìn)一步發(fā)展，終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
研究細(xì)胞死亡的方式對(duì)研究藥物作用于細(xì)胞的機(jī)制是非常重要的。細(xì)胞死亡的方式根據(jù)病理上的分類有兩種形式，一種是細(xì)胞壞死，另一種是細(xì)胞凋亡，這是指一種有秩序、受控制并按某種預(yù)定程序發(fā)展的生理性自然死亡過程（參見第十一章）。有的藥物可能只通過其中一種形式，而有的藥物作用機(jī)制可能二者兼而有之。下表列出了二者的一些區(qū)別（表13-9）。
                      表13–9  細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的比較

 
 (5) 細(xì)胞增殖和存活測(cè)定：前面提到的用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察和計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，不能反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。如若精確測(cè)定細(xì)胞的增殖和存活，則需進(jìn)行克隆形成率（反映細(xì)胞的存活率）和克隆大小測(cè)量（反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況）。
(6) 藥物遺傳毒性測(cè)試：反映化學(xué)藥物的遺傳毒性的檢測(cè)可以分為四類：DNA損傷、基因突變、細(xì)胞遺傳學(xué)改變（染色體畸變和姐妹染色單體互換）、細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些檢測(cè)呈對(duì)一個(gè)藥物的常規(guī)測(cè)試。
1)對(duì)DNA的損傷檢測(cè)
方法一：
【原理】
DNA鏈的斷裂呈化學(xué)物對(duì)DNA造成損傷的一種常見形式。其常作的檢測(cè)方法是DNA解旋的熒光測(cè)定（fluorescntric assay of DNA unwinding，F(xiàn)ADU）。其原理是：DNA在變性液里會(huì)發(fā)生DNA解旋，如果DNA的分子存在鏈的斷裂，這種解螺旋的速度會(huì)加快，此時(shí)溴化乙錠（EB）在堿性溶液中特異性地嵌入DNA中而引起熒光值增加。通過測(cè)定熒光Qd值，即可檢測(cè)DNA斷裂情況。
【操作】
①細(xì)胞懸液制備：用常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，使其細(xì)胞濃度為1×10⁶個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組設(shè)T（未變性）、B（空白）和P（部分變性）三組，實(shí)驗(yàn)組只設(shè)Pi（部分變性）組，每組三個(gè)平行管，每管0.6ml。
②每管細(xì)胞中加入0.6ml裂解液（9mmol/L尿素，10mmol/L NaOH，2.5mmo/L EDTA，0.3％ Sarcosyl），待15分鐘后細(xì)胞裂解，T組加1.2ml抗變性液（1mol/L葡萄糖，14mmol/L巰乙醇），各管沿管壁小心加入變性液I（0.4體積裂解液溶于0.2mol/L NaOH）和變性液Ⅱ（0.4體積裂解液溶于0.2 mol/L NaOH）各0.3ml。然后B管立即超聲處理（功率20％）20秒。變性溫度和時(shí)間為0℃，30分鐘，15℃，30分鐘，變性時(shí)需避光進(jìn)行。B、P和Pi組各加入溴化乙錠液（1μg/L EB溶于13.3mmol/L NaOH），室溫下MPF-4熒光分光光度計(jì)熒光測(cè)定，條件為激發(fā)光波長(zhǎng)520nm，熒光波長(zhǎng)590nm。
③由T、P、B管熒光值計(jì)算殘存雙鏈DNA百分?jǐn)?shù)（D）：
              D＝[(P—B)／(T—B)]×100％
為獲得直線型劑量效應(yīng)關(guān)系曲線引入Qd值：
              Qd＝100(1gPo－lgPi)
Qd值大小反映廠DNA鏈斷裂程度的高低，值越大表明斷裂越多，式中的Po為未處理細(xì)胞D值，Pi為處理的細(xì)胞D值。
方法二：
【原理】
當(dāng)染色體DNA斷裂時(shí)，分子量與完整的基因組DNA相比比較小，通過離心可與之分離用熒光物質(zhì)Hoechst33258染色，計(jì)算DNA的斷裂的比率。
【操作】
①1000g離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用lml裂解液（10mmol/L Tris-Cl，pH7#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#.5，1mmol/L EDTA，0.2％TritonX-100）裂解2分鐘。
②13 000g離心20分鐘，含有斷裂的DNA存在上清里，轉(zhuǎn)移上清**一新的管中；而完整的DNA存在沉淀中，用超聲破碎。
③向兩部分溶液中分別加入等體積的lμg/ml Hoechst33258，37℃染色20分鐘。
④于熒光分光光度汁檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)360nm，熒光波長(zhǎng)450nm，計(jì)算斷裂DNA占總DNA的百分?jǐn)?shù)。
2) 基因突變的檢測(cè)；
【原理】
人類和嚙齒類動(dòng)物的正常細(xì)胞內(nèi)X染色體上含有次黃嘌嶺—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HG-PRT），它能代謝嘌呤類似物6–硫代鳥嘌嶺（6-TG）或8–氮雜鳥嘌呤（8-AG），形成一種致死性的核苷-5’磷酸鹽，從而殺死正常細(xì)胞。在致癌物或致突變物的作用下，細(xì)胞X染色體上控制的HGPRT結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，不能再產(chǎn)生HGPRT，從而使細(xì)胞對(duì)6-TG具有抗性，這些細(xì)胞能夠在含有6-TG的培養(yǎng)液中長(zhǎng)成集落。凡能引起堿基替換、移碼突變、缺失和基因重組的誘變劑，均能引起HGPRT基因位點(diǎn)突變，這種突變是不可逆的。已經(jīng)廣泛用于輻射劑量估算、遺傳毒理學(xué)誘變機(jī)制等研究。
【操作】
①正常細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中加入測(cè)試藥物，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)要設(shè)立對(duì)照組,包括陽性對(duì)照（可以用苯并芘）和陰性對(duì)照組，而且藥物要有濃度梯度。
②37℃培養(yǎng)30小時(shí)，加入6μl/ml細(xì)胞松弛素B，繼續(xù)培養(yǎng)42小時(shí)。
③棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次。
④細(xì)胞懸液經(jīng)冰醋酸：甲醇（1︰3）固定。
⑤制片，Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)雙核和多核細(xì)胞數(shù)。
⑥計(jì)算HGPRTJI基因突變變異子數(shù)，即含6-TG培養(yǎng)的1000個(gè)細(xì)胞中雙核或多核細(xì)胞數(shù)除以不含6-TG培養(yǎng)的1000個(gè)細(xì)胞中雙核細(xì)胞數(shù)或多核細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果反映細(xì)胞HGPRT基因損傷情況。基因突變的劑量–效應(yīng)關(guān)系，隨致突變劑劑量增加而增加。
3)染色體畸變?cè)囼?yàn)：
【原理】
用于染色體畸變檢測(cè)的細(xì)胞有人和動(dòng)物的末梢血淋巴細(xì)胞，細(xì)胞系有中G倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、中G地鼠肺成纖維細(xì)胞（V79）和中G倉(cāng)鼠肺細(xì)胞系（CHL）、人胚肺2倍體成纖維細(xì)胞，**常用的是外周血淋巴細(xì)胞和CHL，在我G新藥的染色體畸變?cè)囼?yàn)推薦的**細(xì)胞為CHL，其染色體為25條。外周血中的小淋巴細(xì)胞幾乎都處于細(xì)胞周期的G₁和G₀期，一般條件下不會(huì)再分裂，當(dāng)培養(yǎng)物中加入PHA，在37℃下，經(jīng)52～72小時(shí)的培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞開始轉(zhuǎn)化，進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，此時(shí)可獲得大量的有絲分裂的細(xì)胞。再經(jīng)過秋水仙素處理，低滲、固定后在顯微鏡下可以觀察到良好的中期染色體分裂象。當(dāng)電離和化學(xué)有害物質(zhì)作用時(shí)均可引起染色體的損傷，且與劑量呈良好的線性關(guān)系。
【操作】
①用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，把細(xì)胞分為五組，即陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和三個(gè)劑量組。**高劑量和**低劑量相差10倍，中間再設(shè)一個(gè)劑量，陽性對(duì)照物為已知的染色體斷裂劑，如絲裂霉素C，劑量為0.02μg/ml；黃曲霉素毒素B，濃度為10^-6mol/L等。每組設(shè)三個(gè)平行樣品。
②收集細(xì)胞，加入含有PHA的培養(yǎng)基（如果用CHL細(xì)胞則不需加），37℃培養(yǎng)52～72小時(shí)。
③加入40μg/ml秋水仙素0.05～0.1ml，終溶度為0.4～0.8μg/ml，37℃培養(yǎng)4小時(shí)。
④收集細(xì)胞，加入8ml 0.075 mol/L KCI低滲液，制成單細(xì)胞懸液，37℃、20分鐘。
⑤離心收集細(xì)胞，加入3ml冰醋酸︰甲醇（1︰3）固定細(xì)胞，用吸管輕輕吹打后，立即離心收集細(xì)胞。加入10ml冰醋酸︰甲醇（1︰3）處理15分鐘。反復(fù)操作2次，每次15分鐘。
⑥取出冰預(yù)冷的載玻片，每片滴加1～2滴細(xì)胞懸液，吹散后，自然干燥后，在顯微鏡下觀察有無細(xì)胞分裂象。
⑦Giemsa染色15分鐘，用自來水沖洗殘留液體，干燥后顯微鏡下觀察。進(jìn)行染色體畸變計(jì)數(shù)，并攝像。畸變的類型有斷片（F）、雙著絲粒（D）、環(huán)（R）、互換（E）等，電離輻射常見斷片、雙著絲粒、環(huán)等，而化學(xué)藥物常見單體斷裂。結(jié)果表示為：
    總畸變率(％)＝(各種畸變類型細(xì)胞數(shù)／分析總細(xì)胞數(shù))×100％
    畸變率(％)＝(染色體畸變數(shù)／染色體總數(shù))×100％
    如果采用CHL進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果判定是：

 
姐妹染色單體互換試驗(yàn)
【原理】
當(dāng)細(xì)胞在加有BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）的培養(yǎng)基中進(jìn)行有絲分裂時(shí)，BrdU能取代胸腺嘧啶核苷酸而摻入到新復(fù)制的DNA鏈中。在經(jīng)歷了兩個(gè)分裂周期，細(xì)胞中期染色體上的兩條姐妹染色單體一條被BrdU半取代，即單鏈取代，另一條的雙鏈都含有BrdU，即雙鏈取代。兩者這種差別可借不同的染色方法將其分別開來，雙鏈都含有BrdU的染色單體在Giemsa染色的情況下染色淺，而一股鏈含有BrdU的染色單體染色深，這種姊妹染色單體上染色深淺相間的現(xiàn)象稱為姐妹染色單體分化現(xiàn)象（SCD）。已分化的兩條染色單體之間如發(fā)生等位點(diǎn)交換的現(xiàn)象，稱為染色單體互換（SCE）。
【操作】
①按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)CHO細(xì)胞，加入受試物，作用2小時(shí)（亦可采用外周血細(xì)胞培養(yǎng)，但在培養(yǎng)過程中加入PHA）。
②棄去培養(yǎng)液，用Hanks液洗滌3次。
③加入含BrdU l0μg/ml的完全培養(yǎng)液5ml，于避光條件下培養(yǎng)24～27小時(shí)。
④加入秋水仙素1～2滴（終濃度為0.2μg/m1），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，收集細(xì)胞。
⑤按常規(guī)用0.075 mol／L KCl低滲、冰醋酸；甲醇（1︰3）固定，制片。
⑥標(biāo)本在37℃條件下光化24小時(shí)后，置于大培養(yǎng)皿中，上蓋以擦鏡紙，滴加2×SSC液，以溶液不漫沒玻片而能保持標(biāo)本濕潤(rùn)為止。
⑦將大培養(yǎng)皿移**60℃水浴箱上，用20W紫外燈距離5cm垂直照射30分鐘。
⑧去掉擦鏡紙，以3％Giemsa染液染色15分鐘，自來水沖洗，晾干，鏡檢。
⑨以每個(gè)細(xì)胞SCE數(shù)計(jì)算SCE頻率，每個(gè)樣品**少觀察25 ~ 50個(gè)細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
BrdU溶液**好現(xiàn)配現(xiàn)用，一次用不完，必須用黑紙（布）避光，4℃冰箱內(nèi)保存。
BrdU溶液強(qiáng)致突變劑，使用濃度不宜太高，在25μg/ml左右的劑量下對(duì)細(xì)胞增殖無影響。在培養(yǎng)24小時(shí)后加入均可。
用紫外線照射誘發(fā)姐妹染色單體互換時(shí)，如果紫外燈功率大，照射時(shí)間應(yīng)相應(yīng)減少。
經(jīng)過t顯著性檢驗(yàn)后，**少有一個(gè)劑量組SCE頻率超過對(duì)照組2倍，即相當(dāng)對(duì)照組SCE頻率3倍者為強(qiáng)陽性；若三個(gè)劑量組超過對(duì)照組SCE頻率且有量效關(guān)系，井其中**少有一個(gè)劑量組與對(duì)照組有非常顯著性差異（P<0.001）者為弱陽性，否則為陰性。
5)細(xì)胞短期轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（藥物致癌實(shí)驗(yàn)）：細(xì)胞轉(zhuǎn)化是細(xì)胞發(fā)生涉及到DNA或基因改變，導(dǎo)致遺傳性狀改變的一種變化。細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后的性狀可以代代相傳，能夠長(zhǎng)期維持和存在。觀察藥物對(duì)細(xì)胞是否有誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用是研究藥物是否有致癌作用的常規(guī)技術(shù)。
【原理】
體外培養(yǎng)的細(xì)胞在受電離輻射或化學(xué)致癌物的作用下，可發(fā)生細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，包括細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化及生長(zhǎng)特性的改變，并形成轉(zhuǎn)化克隆，而且大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)化與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)有密切的關(guān)系。一般細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的周期需2～3個(gè)月，而應(yīng)用敘利亞金黃地鼠胚胎細(xì)胞（SHE）作為靶細(xì)胞，經(jīng)致癌因子作用后第9天即可檢測(cè)出細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化。此試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵褟V泛用于環(huán)境致癌物和各種藥物未知致痛性的檢測(cè)，成為細(xì)胞毒理學(xué)中一個(gè)基本的實(shí)驗(yàn)方法和手段。
【方法與步驟】
①原代細(xì)胞的制備及接種：采用常規(guī)建立細(xì)胞系的方法，取妊娠10～20天的敘利亞金黃地鼠的胚胎制備原代細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。每個(gè)培養(yǎng)瓶加入1ml細(xì)胞懸液，2ml完全培養(yǎng)液及雙抗，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
②飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：直接采用次代培養(yǎng)的SHE細(xì)胞制備，每平方厘米生成面積接種3.3×10⁴個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為RPMI–1640或Eagle完全培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)3～5天。待細(xì)胞80％聚集時(shí)，進(jìn)行X射線或⁶⁰Coγ射線照射，劑量為5.0Gy。照射時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)面朝上，照射后立即用胰蛋白酶消化，然后加入10％小牛血清的完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×l0⁴個(gè)/mL，接種4×10⁴個(gè)細(xì)胞（2ml）于一系列25m1培養(yǎng)瓶中。受試物每—濃度組及對(duì)照組各12瓶平行樣，置37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，即可接種靶細(xì)胞。因飼養(yǎng)層細(xì)胞受到照射，細(xì)胞體積大，不增殖，形態(tài)特異，易與靶細(xì)胞區(qū)別開。
也可用地鼠肝細(xì)胞制作飼養(yǎng)層細(xì)胞，其可使測(cè)試系統(tǒng)代謝活化能力提高數(shù)十倍**數(shù)百倍，而且無細(xì)胞毒性。
③靶細(xì)胞的制備：取凍存的SHE細(xì)胞，作常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80％～90％融合時(shí)，即可用胰蛋白酶消化1～1.5分鐘，以完全培養(yǎng)液稀釋**300個(gè)細(xì)胞/ml，取1ml細(xì)胞懸液接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，總體積3ml。37％下培養(yǎng)24小時(shí)，加入受試物，可設(shè)立三個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組，一個(gè)陽性對(duì)照組（如3-甲基膽蒽，3-MAC或N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍，MNNG），濃度一般為1μg/ml左右。若受試物不溶于水，可先用二甲亞砜溶解，二甲亞砜在培養(yǎng)液中的濃度為0.02％（V/V）。加入受試物后，37℃下連續(xù)培養(yǎng)8天，此時(shí)細(xì)胞既不傳代，也不換培養(yǎng)液。
④固定、染色：細(xì)胞培養(yǎng)**第9天，棄去培養(yǎng)液，用pH6.8磷酸緩沖液將貼壁細(xì)胞洗2次，**后加入甲醇3～5ml固定20分鐘，再用Giemsa染液染色20分鐘，**后經(jīng)雙蒸水沖洗，晾干。
⑤鏡檢：在低倍鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化克隆的形態(tài)。轉(zhuǎn)化克隆的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)無方向性，排列紊亂，形成交叉、旋渦、復(fù)層生長(zhǎng)（三維空間生長(zhǎng)），染色深。正常細(xì)胞不形成克隆，或形成的克隆細(xì)胞生長(zhǎng)有一定方向性，排列規(guī)則，基本上單層生長(zhǎng)，染色淺。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
⑥轉(zhuǎn)化克隆的判斷：為了便于判斷克隆是否發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化，可將每個(gè)克隆劃分為三個(gè)區(qū)域。中心區(qū)：細(xì)胞**致密，常呈三維空間生長(zhǎng)，細(xì)胞界限不清，非轉(zhuǎn)化克隆無此現(xiàn)象。外周區(qū)：自中心區(qū)邊緣向克隆周邊延伸，在此區(qū)域中細(xì)胞單層生長(zhǎng)，但排列不規(guī)則，形成交叉、重疊，而正常細(xì)胞呈方向性生長(zhǎng)。細(xì)胞稀疏的區(qū)域：在克隆外周區(qū)之外可有一個(gè)細(xì)胞群體很稀疏的區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)，細(xì)胞間隙較大，生長(zhǎng)較紊亂，細(xì)胞突起重疊，但不典型。此區(qū)域中細(xì)胞形態(tài)不能作為判定轉(zhuǎn)化克隆的依據(jù)。
⑦判定陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Dumkel等的建議，SHE細(xì)胞準(zhǔn)化試驗(yàn)中符合以下標(biāo)準(zhǔn)者即可判定為陽性結(jié)果：明確的劑量–效應(yīng)關(guān)系。兩個(gè)連續(xù)劑量組中都有2個(gè)或2個(gè)以上的轉(zhuǎn)化克隆。單個(gè)劑量組中，有3個(gè)或3個(gè)以上的轉(zhuǎn)化克隆。
若出現(xiàn)以下情況中，僅屬可疑陽性：?jiǎn)蝹€(gè)劑量組中，只出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)轉(zhuǎn)化克隆者。在兩個(gè)不連續(xù)的劑量組中，出現(xiàn)1～2個(gè)轉(zhuǎn)化克隆者。在兩個(gè)連續(xù)的劑量組中，僅出現(xiàn)1個(gè)轉(zhuǎn)化克隆者。
據(jù)此尚難做出明確判斷者，需做其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定，將所形成的克隆分離出來，進(jìn)行染色體數(shù)目和核型分析、細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)、半固體瓊脂培養(yǎng)基中集落開形成率測(cè)定、動(dòng)物接種致瘤試驗(yàn)，以增強(qiáng)結(jié)果的可靠性。其中半固體瓊脂培養(yǎng)**為可靠，當(dāng)動(dòng)物接種時(shí)出現(xiàn)腫物生長(zhǎng)并結(jié)合病理確診則**有說服力。
【注意事項(xiàng)】
胚胎原代細(xì)胞比傳代細(xì)胞易轉(zhuǎn)化，同窩動(dòng)物的胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果較穩(wěn)定。
小牛血清必須及時(shí)滅活，無微生物、支原體污染。活力低的血清或污染血清不易使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。
培養(yǎng)液配制保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)降低細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。
**接種的細(xì)胞密度應(yīng)高一些，由于接觸抑制作用，減少細(xì)胞倍增次數(shù)，可提高轉(zhuǎn)化率，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化率。
 
第五節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)在臨床中的應(yīng)用
    
臨床醫(yī)學(xué)是認(rèn)識(shí)和防治疾病、保護(hù)和增進(jìn)人體健康的科學(xué)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在疾病的診斷、治療上有重要的應(yīng)用。近年來的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和其他基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)如分子生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等促進(jìn)了臨床醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展。
 
一、細(xì)胞培養(yǎng)在臨床診斷中的應(yīng)用
    
1．細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)臨床上的病原研究起了很大的推動(dòng)作用  一些疾病通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得以發(fā)現(xiàn)和確定病原。臨床上多種致病病原如細(xì)菌、病毒、寄生蟲等的確定和藥物敏感試驗(yàn)是通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)完成的。如臨床上廣泛進(jìn)行的對(duì)呼吸道、泌尿生殖道分泌物的病原菌培養(yǎng)和篩選敏感抗生素。通過培養(yǎng)確認(rèn)病原的方法，人們也新發(fā)現(xiàn)和診斷了多種以往不能明確的疾病類型，如艾滋病病毒就是通過細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的。使用組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可對(duì)已知的病毒(如脊髓灰質(zhì)炎、麻疹病毒、腮腺炎病毒等)進(jìn)行深入的研究，還有助于發(fā)現(xiàn)大量人類未知的腸道和呼吸道病毒，這些病毒在雞胚和小鼠中并不繁殖。
目前在臨床上應(yīng)用微量全血培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行珍斷HIV感染，用于兒童HIV垂直感染的早期診斷及可疑感染者的確認(rèn)。HIV分離培養(yǎng)是當(dāng)今HIV垂直感染診斷的依據(jù)，早期雖然已有常規(guī)培養(yǎng)方法來檢測(cè)HIV，但這些技術(shù)依賴于血液成分的分離，花時(shí)間并難以從兒童得到有效血量。血清學(xué)檢測(cè)在<24個(gè)月齡的小兒中有一定的局限性，其主要原因是因?yàn)?4個(gè)月內(nèi)的嬰兒體內(nèi)可能仍存有母體的HIV抗體，而ELISA法不能確定抗HIV抗體是來源于母親還是嬰兒自身產(chǎn)生。為此，Bayliss等人**用微量全血培養(yǎng)法從HIV／AIDS感染者血液中分離出HIV病毒。
2．細(xì)胞培養(yǎng)在臨床病因診斷中的應(yīng)用
(1)造血系統(tǒng)疾病診斷：造血或血細(xì)胞生成是一個(gè)復(fù)雜的、多層次的細(xì)胞分化生物過程，
包括造血干細(xì)胞的自我更新和分化增殖。其分化增殖產(chǎn)生各系列定向造血祖細(xì)胞，后者進(jìn)一步增殖分化產(chǎn)生成熟的血細(xì)胞。造血這一過程需要一個(gè)適合的微環(huán)境，又受到局部和全身的生長(zhǎng)因子、抑制因子的調(diào)節(jié)。造血于祖細(xì)胞的研究，可使人們了解造血的正常生理過程，包括其分化、成熟及調(diào)節(jié)機(jī)制。
正常人骨髓中多能造血干細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的0.4％，定向祖細(xì)胞約占3％。外周血中的比例更低。由于這些細(xì)胞在一般形態(tài)上與淋巴細(xì)胞無明顯差別，不能直觀地研究其特性。因此主要通過骨髓和血液細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，根據(jù)其增殖能力和所形成集落的特征不同，將不同的細(xì)胞加以區(qū)分。現(xiàn)在也可以通過象免疫磁珠等方法先進(jìn)行干祖細(xì)胞的純化分離，再進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。造血細(xì)胞的培養(yǎng)分析則已作為造血干細(xì)胞克隆性疾病的診斷和治療效果分析的常用方法。G內(nèi)外使用的造血細(xì)胞培養(yǎng)方法有許多種，按培養(yǎng)基形態(tài)可分為液體培養(yǎng)法和半固體培養(yǎng)法；按半固體培養(yǎng)支撐物的種類可分為血漿凝塊法、瓊脂法和甲基纖維素法；按血清的有無可分為無血清液體培養(yǎng)法和血清半固體培養(yǎng)法等。
造血干細(xì)胞可向多種定向祖細(xì)胞分化增殖，所以不同類型的造血干細(xì)胞克隆性疾病如骨髓增生異常綜合征（MDS）、急慢性白血病、再生障礙性貧血（AA）、骨髓增殖性疾病（MPD）等造血細(xì)胞的集落分析均有一定特點(diǎn)。目前已發(fā)展了多種造血細(xì)胞的培養(yǎng)體系，即在常規(guī)培養(yǎng)基中應(yīng)用不同的細(xì)胞因子組合用以培養(yǎng)和擴(kuò)增不同的定向祖細(xì)胞。如混合集落形成細(xì)胞（CFU-Mix）培養(yǎng)、粒單細(xì)胞集落形成細(xì)胞（CFU-GM）培養(yǎng)、巨核細(xì)胞系集落形成細(xì)胞（CFU-MK）培養(yǎng)、紅系祖細(xì)胞（BFU-E）培養(yǎng)、成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞（CFU-E）分析和骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)等。重癥再生障礙性貧血患者的骨髓、外周培養(yǎng)血幾乎都無集落形成，可認(rèn)為是CFU-Mix階段障礙；MDS病人的CFU-GM培養(yǎng)常表現(xiàn)為集落減少而集簇增多；AML骨髓粒–單核系祖細(xì)胞（CFU-GM）集落不生成或生成很少，而集簇?cái)?shù)目增多。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
(2)與染色體變化相關(guān)疾病的診斷：染色體分析亦稱核型分析（karyotype analysis），是在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)專門技術(shù)。目前隨著顯帶技術(shù)的應(yīng)用以及高分辨率染色體顯帶技術(shù)的出現(xiàn)和改進(jìn)，能更準(zhǔn)確地判斷和發(fā)現(xiàn)更多的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常綜合征，如21三體綜合征等，還可以發(fā)現(xiàn)新的微畸變綜合征。染色體分析標(biāo)本的來源，主要取自骨髓、外周血、絨毛、羊水中胎兒脫落細(xì)胞和臍血、皮膚等各種組織。由于只有處于中期的染色體才能在光學(xué)顯微鏡下看到它的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，因此染色體分析均需用正在分裂的細(xì)胞。體內(nèi)一般只有骨髓細(xì)胞含有足夠比例的處于有絲分裂的細(xì)胞，其他細(xì)胞均需要通過一定條件的培養(yǎng)使之達(dá)到分析的要求。外周血淋巴細(xì)胞因其容易獲得，也常用于體細(xì)胞染色體畸變的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。一般來說，在有分裂原（如植物血凝素、美洲商陸分裂素或伴刀豆球蛋白A）存在的情況下，培養(yǎng)肝素化的血細(xì)胞以刺激非周期的淋巴細(xì)胞，之后用秋水仙素處理使其停止在分裂中期相，然后用低滲培養(yǎng)液處理，使細(xì)胞核體積漲大，**后用甲醇／冰乙酸固定細(xì)胞并制片，用Giemsa染色或進(jìn)行染色體G顯帶分析。
染色體分析是產(chǎn)前診斷的主要內(nèi)容之一。近20余年來，遺傳學(xué)家對(duì)大量流產(chǎn)兒進(jìn)行了與遺傳有關(guān)的細(xì)胞核內(nèi)染色體的研究，發(fā)現(xiàn)50％～60％的流產(chǎn)兒具有異常染色體，包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。這些染色體異常導(dǎo)致了胚胎發(fā)育的障礙，造成妊娠中斷。臨床上對(duì)多次流產(chǎn)、曾生育過先天愚型、在妊娠早期有明顯致畸因素接觸的夫婦，都建議做產(chǎn)前宮內(nèi)診斷。如可在妊娠15～17周時(shí)羊膜囊穿刺進(jìn)行羊水的化學(xué)分析和羊水細(xì)胞的染色體分析；妊娠8周時(shí)即可進(jìn)行絨毛膜活檢診斷胚胎的染色體異常，達(dá)到早期診斷的目的。通過這些產(chǎn)前診斷方法，可將有遺傳病或先天畸形的胎兒篩查出來，進(jìn)行選擇性流產(chǎn)，控制多種遺傳病的垂直遺傳，達(dá)到生育健康后代的目的。
除產(chǎn)前診斷外，染色體分析更多的是用于腫瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)研究。現(xiàn)代腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)的一個(gè)主要結(jié)論是，腫瘤細(xì)胞的核型變化是不一致地分布在整個(gè)染色體組中，不同的腫瘤與不同的染色體區(qū)、帶有關(guān)系。即腫瘤的發(fā)生與非隨機(jī)性染色體異常密切相關(guān)。截**目前，80％以上的腫瘤特異性細(xì)胞遺傳學(xué)異常，是在血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)現(xiàn)和被研究的，因此細(xì)胞遺傳學(xué)檢查已成為臨床診斷白血病、判斷預(yù)后和觀察治療效果的重要方法學(xué)之一。
Ph染色體是**早發(fā)現(xiàn)特異性地與惡性腫瘤有關(guān)的異常染色體，早在1960年Nowell和Hungerford就在慢性髓細(xì)胞性白血病（CML）中發(fā)現(xiàn)了特征性Ph小體，1972年芝加哥大學(xué)**細(xì)胞遺傳學(xué)家Rowley證實(shí)，Ph染色體是由第9號(hào)染色體和第22號(hào)染色體交互易位所致。其后的分子生物學(xué)研究又進(jìn)一步證實(shí)了這兩條染色體易位的結(jié)果是22號(hào)染色體上的BCR基因與9號(hào)染色體上的ABL。基因相融合，后來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則表明了BCR–ABL融合基因正是造成CML發(fā)病的原因。由于在90％以上的慢性髓細(xì)胞性白血病病人中可以檢測(cè)到該異常染色體和融合基因，且其異常染色體的比例和融合基因的數(shù)量與治療效果和疾病狀態(tài)密切相關(guān)，對(duì)該染色體的檢查已作為疑診和已確診CML病人的常規(guī)檢查。
20世紀(jì)80年代以來，染色體分析發(fā)現(xiàn)90％急性白血病有核型異常，特別是染色體易位，因而提出了白血病的MIC（形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)）分型方法。目前認(rèn)為急性髓性白血病（AML）中較常見的依次為t（8；21)、[（15；7）、inv（16）/del（16）、t（9；22）等，尤其發(fā)現(xiàn)85％左右M2b存在t（8；21），90％以上急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）有t（15；17）易位。從染色體易位的斷裂點(diǎn)已經(jīng)分離出確切的融合基因，如t（8；21）的AML/ETO融合基因，t（15；17）的PML-RARa融合基因，t（9；22）的BCR–ABL融合基因，以及與11號(hào)染色體有關(guān)的MLL等。
(3)疾病預(yù)后：細(xì)胞培養(yǎng)在診斷疾病的預(yù)后也具有一定的作用。如重癥再生障礙性貧血的病人，其骨髓集落培養(yǎng)，BFU–E的減少與病情嚴(yán)重程度是一致的；AML病人的在用藥物后緩解后，如果骨髓的CFU–GM培養(yǎng)檢測(cè)，原本減少的集落又恢復(fù)生長(zhǎng)，而當(dāng)復(fù)發(fā)前集落又減少，所以對(duì)估計(jì)預(yù)防復(fù)發(fā)也有一定的意義。
細(xì)胞遺傳學(xué)分析提供了一些非常有用的預(yù)后信息。AML中預(yù)后較好的細(xì)胞遺傳學(xué)異常包括t（8；21）、inv（16）、t（15；17）。如有特征性的染色體5q，7q缺失或單倍體3號(hào)染色體的易位或者倒位，t（6；9）、t（9；22）及染色體11q23異常，均提示AML病人預(yù)后差。急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）中Ph染色體陽性者占約30％，預(yù)后不良。
 
二、細(xì)胞培養(yǎng)在臨床治療中的應(yīng)用
    
運(yùn)用細(xì)胞進(jìn)行疾病的治療是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)的一大進(jìn)步，它使得一些傳統(tǒng)的治療方法束手無策的疾病得到改善，甚**治愈。這種療法稱體細(xì)胞治療，它是指應(yīng)用人體、異體或異體（非人體）的體細(xì)胞，經(jīng)體外操作后回輸（或植入）到人體的療法。傳統(tǒng)的全血輸注、成分輸血、自體和異基因骨髓移植、臍血移植等均屬于體細(xì)胞治療的范圍。這些方法主要涉及細(xì)胞的采集、保存和運(yùn)輸。
體細(xì)胞治療的類型可以分為三類：①細(xì)胞的輸入和植入，旨在體內(nèi)釋放某些因子，如酶、細(xì)胞因子、凝血因子等。②輸入激活的淋巴細(xì)胞，如淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL），以及其他能殺傷腫瘤的細(xì)胞。③植入經(jīng)過體外操作的細(xì)胞群，如肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、干細(xì)胞、胰島細(xì)胞等，以求其在體內(nèi)發(fā)揮復(fù)合生物活性作用。干細(xì)胞的研究與應(yīng)用被美G《Science》雜志為1999年世界十大科技成果之一，取自人胚胎或骨髓的干細(xì)胞可用于培育不同的人體細(xì)胞、組織或器官，這有望成為移植器官的新來源。組織器官移植有可能成為21世紀(jì)人類攻克某些重大疾患（如心腦疾病、血液系統(tǒng)疾病等）的根本措施。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
下面介紹一些臨床常用的細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增。
1．造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增  造血干細(xì)胞自我更新的性能使其復(fù)制方式為不對(duì)稱分裂，且缺乏可靠的人類干細(xì)胞定量檢測(cè)方法，因此，目前還難以對(duì)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，但CD34⁺造血祖細(xì)胞具有良好的擴(kuò)增反應(yīng)。這種擴(kuò)增具有很好的臨床應(yīng)用前景，一方面可以解決常規(guī)異體移植的配型以及移植物抗宿主反應(yīng)，另一方面由于采用少量病人的血液，可以避免自身腫瘤細(xì)胞污染、供血量不足等問題。
取骨髓、動(dòng)員外周血、臍帶血，用淋巴細(xì)胞分離液分離的單個(gè)核細(xì)胞，用20％馬血清MEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD34⁺細(xì)胞的篩選。CD34⁺細(xì)胞在SCF、IL-1、IL-3、IL-5、GM-CSF、C-CSF、EPO、PIXY321等細(xì)胞因子的不同組合刺激下，經(jīng)8~14天即可擴(kuò)增細(xì)胞總數(shù)30～1000倍，集落形成細(xì)胞（包括CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMN）也可被擴(kuò)增41~190倍。但這些因子的組合在擴(kuò)增造血細(xì)胞的同時(shí)，也明顯地加速了造血干／祖細(xì)胞的分化，**21天時(shí)，jue大部分細(xì)胞已分化為較成熟的血細(xì)胞，因此，如何在擴(kuò)增造血細(xì)胞的同時(shí)，又盡可能地保留造血干細(xì)胞并擴(kuò)增早期造血祖細(xì)胞，使其在數(shù)量上和功能上滿足臨床治療的需要，這就成為體外擴(kuò)增研究的重點(diǎn)。近年來，經(jīng)過各G學(xué)者的不斷努力，此方面的研究已取得了明顯的進(jìn)展，已經(jīng)有報(bào)道，白血病人經(jīng)過大劑量化療后，應(yīng)用其外周血擴(kuò)增的細(xì)胞可以重建病人的造血系統(tǒng)。
2．造血祖細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化  擴(kuò)增造血祖細(xì)胞的同時(shí)，也明顯的加速了其分化，這是造血祖細(xì)胞擴(kuò)增所面臨的一個(gè)難題，但同時(shí)又為我們展開了一個(gè)新的研究*域，即利用造血干／祖細(xì)胞具有多向分化的潛能，通過細(xì)胞因子的不同組合，定向的誘導(dǎo)其分化，產(chǎn)生大量所需的功能細(xì)胞（如紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等），滿足基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的需要，這在新一代的細(xì)胞免疫治療中將具有十分重要的意義。
(1) 粒系和紅系細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化：裴雪濤等利用SCF+IL-3+G-CSF+GM-CSF／或TPO的組合誘導(dǎo)CD34⁺細(xì)胞向粒系分化，5～7天后體系中的粒細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，10天時(shí)CFU-GM增加了12.87～14.46倍，且出現(xiàn)大量的中性粒細(xì)胞；而SCF+ IL-3+EPO+TPO則可擴(kuò)增BFU-E 15倍，同時(shí)體系中出現(xiàn)大量血紅蛋白分泌及網(wǎng)織紅細(xì)胞。
(2) 巨核細(xì)胞和血小板的定向誘導(dǎo)分化：TPO對(duì)巨核系造血祖細(xì)胞的增殖分化、血小板的生成及系特異性標(biāo)志的表達(dá)均具有明顯的刺激作用。裴雪濤等利用因子SCF+IL-3+IL-6+TPO進(jìn)行CFU-MK和細(xì)胞CD4la⁺擴(kuò)增，于第14天達(dá)17～35倍。此外，TPO還可加速CFU–MK進(jìn)一步分化成熟，誘導(dǎo)巨核細(xì)胞在胞漿內(nèi)形成凸出的界膜系統(tǒng)、血小板特異性顆粒及“血小板區(qū)”，**終分裂形成血小板。
(3) 樹突狀細(xì)胞（DC）的定向誘導(dǎo)擴(kuò)增：DC是體內(nèi)**有效的抗原提呈細(xì)胞（APC）之一，通過其表面的B7、MHC–Ⅱ類分子、ICMC–1等共刺激分子，激活T輔助細(xì)胞，促使其分泌IL-2等細(xì)胞因子，并傳遞特異性抗原信號(hào)，**終激活細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）。因此，在腫瘤免疫及其治療中具有重要意義。
(4) LAK細(xì)胞、NK細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化：?jiǎn)斡肐L-2即可在6～8天誘導(dǎo)CD34⁺細(xì)胞形成NK細(xì)胞，CD3-CD56⁺NK細(xì)胞可擴(kuò)增3～5.4倍，誘導(dǎo)擴(kuò)增的NK細(xì)胞可誘發(fā)移植物抗腫瘤效應(yīng)（GVT），且對(duì)CD34⁺細(xì)胞無明顯影響，SCF、IL-3、IL-15等細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增具有協(xié)同作用。目前在臨床上，外周血白細(xì)胞經(jīng)IL-2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)AK細(xì)胞，已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療后的又一種腫瘤治療方法。
(5) 其他細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化：造血干細(xì)胞以及更早期的間質(zhì)干細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)分化為造血基質(zhì)細(xì)胞、骨、肌肉、軟骨、肌腱、韌帶等細(xì)胞和組織，從而使新一代細(xì)胞治療的范圍更加廣闊。
3．自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞   G內(nèi)陸道培等報(bào)道應(yīng)用自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）治療白血病37例，58例次CIK治療，及部分白血病合并丙型病毒性肝炎的效果。采用血細(xì)胞分離機(jī)大量采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，再用抗CD3單杭、白細(xì)胞介素2、干擾素γ培養(yǎng)l0天左右，然后將細(xì)胞洗滌后經(jīng)靜脈回輸給患者。認(rèn)為自體CIK細(xì)胞治療具有明顯清除微小殘留白血病細(xì)胞、防止復(fù)發(fā)的作用，靜脈輸注安全。并且該治療具有明顯抑制甚**清除白血病患者合并丙型肝炎病毒感染的作用，可明顯改善患者的肝功能。
4．腫瘤細(xì)胞疫苗   通過體外細(xì)胞培養(yǎng)獲得腫瘤疫苗一直是人們期待的一種腫瘤主動(dòng)免疫治療手段。雖然目前仍然多在試驗(yàn)階段，其中一些已展示出臨床應(yīng)用的樂觀前景。如回輸患者自身的在體外經(jīng)基因修飾的腫瘤細(xì)胞，小鼠中的實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染G–CSF的腫瘤細(xì)胞可以誘發(fā)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫。近年來對(duì)樹突狀細(xì)胞（DC）作為腫瘤疫苗的研究正如火如荼，DC與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原、腫瘤細(xì)胞裂解物或腫瘤抗原肽（包括合成肽）體外共同孵育，負(fù)載了腫瘤抗原的“抗原肽DC瘤苗”、轉(zhuǎn)基因DC瘤苗、DC與腫瘤細(xì)胞的融合瘤苗等均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體外試驗(yàn)中顯示了良好抗腫瘤主動(dòng)免疫效果。
5．皮膚細(xì)胞培養(yǎng)   在皮膚受到嚴(yán)創(chuàng)傷、燒傷、燙傷時(shí)，大面積深度皮膚缺損創(chuàng)面不能自行修復(fù)，需要進(jìn)行皮膚移植。當(dāng)自體皮膚不能滿足需要時(shí)，需要用異體皮膚和人工皮膚。異體皮膚由于排斥反應(yīng)，一般經(jīng)2～3周后即發(fā)生溶解脫落。人工皮膚是采用組織工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的原理與方法，在體外重組的具有生物學(xué)活性的皮膚類似物，按組成成分不同可分為單純?nèi)斯ふ嫫ず途哂斜砥ぜ?xì)胞層的活性復(fù)合皮。目前，已研制成功多種人工真皮，如來源于異體或異種（豬）皮的無細(xì)胞真皮、以膠原為主要原料經(jīng)冷凍干燥后形成的海綿狀膠原膜，還有透明質(zhì)酸膜、聚乳酸／聚羥基乙酸網(wǎng)狀膜等。它們的基本特點(diǎn)是抗原性弱，生物親和性好，植入創(chuàng)而后降解慢，可誘導(dǎo)自體的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及新生毛細(xì)血管浸潤(rùn)生長(zhǎng)，形成新的、膠原纖維排列規(guī)則的真皮樣組織，從而重建真皮層。復(fù)合皮則是以各種人工真皮為載體，取病人很小的一塊皮膚，分離其中的表皮細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不斷進(jìn)行傳代擴(kuò)增，將擴(kuò)增的細(xì)胞象播種一樣接種在人工真皮上，再培養(yǎng)一段時(shí)間，就可以形成含4～6表皮細(xì)胞層和真皮層的夾心漢堡包式的人工皮。從理論上分析，取4～20cm#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#²自體皮片的表皮細(xì)胞于體外培養(yǎng)2～3星期，可形成1000～10 000cm²的人工皮膚。由于復(fù)合皮同時(shí)含有表皮與真皮層，從而避免了單純表皮細(xì)胞膜片移植不耐磨、易收縮、存活率低的缺陷，又避免了單純?nèi)斯ふ嫫ひ浦踩孕枰浦沧泽w薄皮片的不足。所以，從結(jié)構(gòu)與功能上看，復(fù)合皮構(gòu)成了相對(duì)完整的皮膚。所以從嚴(yán)格意義上來說，復(fù)合皮才是名正言順的人工皮膚。除燒傷外，在大面積的皮膚撕脫傷、瘢痕、慢性難愈性皮膚潰瘍、面部軟組織凹陷等治療中，人工真皮也能發(fā)揮較好的作用，使創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量明顯提高。復(fù)合皮的應(yīng)用可望為大面積皮膚損傷病人提供充足的皮源，并改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。
6．試管嬰兒   由于培養(yǎng)技術(shù)和胚胎學(xué)研究的發(fā)展，生殖醫(yī)學(xué)理論及其臨床高科技技術(shù)也取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。出現(xiàn)了試管嬰兒技術(shù)，這不僅給治療不孕增添了新的方法和手段，而且也使生殖醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論和生命科學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)嶄新的*域。**代試管嬰兒，是英GEdwards與Steptoe醫(yī)生創(chuàng)立的經(jīng)體外受精與胚胎移植，簡(jiǎn)稱IVF-ET。此技術(shù)對(duì)婦女輸卵管不通所致的不孕提供了新的治療方法。第二代試管嬰兒，顯微受精技術(shù)，它包括透明帶部分切割技術(shù)、透明帶受精技術(shù)和單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射受精技術(shù)。由于前二者的成功率比較低，所以第二代試管嬰兒主要呈指單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射受精技術(shù)（ICSl），適用于重度男性因素不孕治療。第三代試管嬰兒，是指胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD），此技術(shù)是在體外受精，當(dāng)受精卵發(fā)育到6～8細(xì)胞期時(shí)．采用顯微技術(shù)取出1～2個(gè)細(xì)胞，采用基因分析或FISH技術(shù)，進(jìn)行遺傳病診斷，去除有病的胚胎，植入正常胚胎而發(fā)育。此技術(shù)對(duì)預(yù)防遺傳病優(yōu)生優(yōu)育發(fā)揮重要作用。
提高種植率是試管嬰兒技術(shù)的重點(diǎn)，其關(guān)鍵在于胚胎培養(yǎng)和囊胚培養(yǎng)技術(shù)。
(1) 胚胎培養(yǎng)：
1）胚胎培養(yǎng)液；現(xiàn)在，市面上有多種胚胎培養(yǎng)液出售（表13-10），其應(yīng)用方法和受精率、妊娠率無明顯差異。目前G內(nèi)應(yīng)用**普遍的是HTF和IVF系列，其有效期短，到貨后有效期往往只有3～4周，容易造成短缺或浪費(fèi)。Q-HTF系列有期較長(zhǎng)，根據(jù)有些中心應(yīng)用情況看，胚胎碎片較多，但臨床妊娠率并不低。各個(gè)生殖中心可以根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)搭配應(yīng)用。
表13-10  常用胚胎培養(yǎng)液

    
2） 胎培養(yǎng)方法：目前多數(shù)中心培養(yǎng)胚胎**第三天移植，采用微滴法胚胎培養(yǎng)，也有一些中心認(rèn)為采用4孔扳胚胎集中培養(yǎng)有助于胚胎生長(zhǎng)，每孔內(nèi)2～3個(gè)胚胎一起培養(yǎng)。原石木郎的研究發(fā)現(xiàn)，第三天以前胚胎單個(gè)培養(yǎng)較好，而第三天以后胚胎聯(lián)合培養(yǎng)有助于囊胚形成。
有的生殖中心采用微滴法，卵裂率89％，第三天有8個(gè)細(xì)胞胚胎可供移植占74.9％。胚胎培養(yǎng)注意問題：①市面出售的胚胎培養(yǎng)液內(nèi)含碳酸鹽緩沖液，孵育時(shí)松開瓶蓋，可使CO₂進(jìn)入，新瓶液體取出后**好分裝，避免多次單開瓶口；②去除顆粒細(xì)胞的當(dāng)天，用已經(jīng)平衡好的培養(yǎng)液滴人生長(zhǎng)皿（一般用Falconm皿 3001），每皿6～8滴，每滴25μl，覆蓋礦物油約2ml；
③ 每滴內(nèi)一般放一個(gè)胚胎。
(2) 囊胚培養(yǎng)：生理情況下，胚胎在輸卵管內(nèi)受精后發(fā)育**囊胚時(shí)進(jìn)入子宮進(jìn)一步卵裂、孵育、著床。改變胚胎移植回子宮的時(shí)間，被認(rèn)為是提高胚胎種植率的方法之一。自1987年以來，移植用的胚胎主要是受精后第2～3天的4～8細(xì)胞胚胎。其原因是培養(yǎng)液以及囊胚培養(yǎng)條件的限制造成的。近來出現(xiàn)的序貫培養(yǎng)液，為囊胚移植提供了有利條件，使第5天移植成為可能。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
1） 培養(yǎng)條件：5%CO₂、5%O₂、90%N₂培養(yǎng)系統(tǒng)降低了氧濃度，低氧環(huán)境使氧自由基產(chǎn)物減少，并可破壞或結(jié)合培養(yǎng)基中的某些毒素。空氣中20%的氧深度不是胚胎**適宜的環(huán)境，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示胚胎在低氧環(huán)境下種植率提高。日前對(duì)這一系統(tǒng)是否有利于培養(yǎng)囊胚的形成仍存在爭(zhēng)議，Noda**報(bào)道了在低氧環(huán)境下，Ealre’s液中培養(yǎng)的胚胎及胚胎移植結(jié)局好轉(zhuǎn)。對(duì)低氧環(huán)境培養(yǎng)體系這一新的手段尚在評(píng)價(jià)之中。
在囊胚培養(yǎng)中要求培養(yǎng)基滿足胚胎在體外不同發(fā)育階段生長(zhǎng)的需要。胚胎卵裂早期需要微量的葡萄糖，胚泡晚期需要大量的葡萄糖，對(duì)丙酮酸的需求則相反。抗氧化牛黃酸對(duì)胚泡的發(fā)展是有價(jià)值的，次黃嘌嶺是有害的。晚期桑椹胚和胚泡階段胚胎需要非必需氨基酸和必需氨基酸，大約在第3天胚胎基因開始活化并轉(zhuǎn)錄，若沒有上述氨基酸，必將阻滯囊胚的形成。囊胚培養(yǎng)早期（第3天以前的卵裂階段），胚胎放在簡(jiǎn)單介質(zhì)（如G1）中生長(zhǎng)，然后，當(dāng)胚胎基因開始活化后，再將胚胎轉(zhuǎn)移到合適介質(zhì)如（G2中）培養(yǎng)，其中不僅包括含鹽、能量底物和蛋白質(zhì)，而且還有氨基酸、維生素和激素。目前囊胚培養(yǎng)基有多種，如G2、P2、Quinn囊胚培養(yǎng)基等。
2） 培養(yǎng)方法：
方法一：共培養(yǎng)法
共培養(yǎng)法是指用單層細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，與胚胎共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)發(fā)育，促進(jìn)囊胚的發(fā)育。目前，共培養(yǎng)所用的細(xì)胞有人輸卵管壺腹部細(xì)胞、vero細(xì)胞（輸卵管上皮細(xì)胞）、胎牛子宮纖維母細(xì)胞、牛輸卵管上皮細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜細(xì)胞、卵丘細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞。共培養(yǎng)法的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始于20世紀(jì)80年代早期，到了90年代對(duì)人類胚胎的共培養(yǎng)液進(jìn)行了大量的研究，人類的胚胎輸卵管細(xì)胞上進(jìn)行受精和生長(zhǎng)（共培養(yǎng)），能夠使胚胎的活力提高。
共培養(yǎng)對(duì)囊胚形成有重要意義，但在IVF*域存在較大爭(zhēng)議，主要有以下幾個(gè)原因：①細(xì)胞捐贈(zèng)人可能的疾病傳播以及利用動(dòng)物細(xì)胞的倫理問題；②由于共培養(yǎng)系統(tǒng)較復(fù)雜，且作用機(jī)制尚未能夠明確和對(duì)應(yīng)用的有效性**今仍有爭(zhēng)議；③由于其培養(yǎng)體系復(fù)雜，可能產(chǎn)生對(duì)胚胎的污染。近年來，共培養(yǎng)已逐漸被序貫培養(yǎng)所代替。
方法二：序貫培養(yǎng)法
序貫培養(yǎng)法已經(jīng)形成并取得了較大的發(fā)展，取代聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)。序貫培養(yǎng)注意到了人體外培養(yǎng)的胚胎再不同時(shí)間里對(duì)代謝需求各不相同，即移植前胚胎的營(yíng)養(yǎng)成分需要改變。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的胚胎用不同的培養(yǎng)基，而每種培養(yǎng)基適合該時(shí)期胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需要。Gardner發(fā)展了G1.2、c2.2序貫培養(yǎng)基，他們建立了這兩種培養(yǎng)基的序貫培養(yǎng)系統(tǒng)。G內(nèi)一些生殖中心也使用G1.2、G2.2序貫培養(yǎng)基培養(yǎng)人囊胚，取得了較滿意的結(jié)果。
3）囊胚培養(yǎng)步驟（其中前三天為胚胎培養(yǎng)）：
①超促排卵，卵子經(jīng)4～6小時(shí)體外培養(yǎng)成熟。
②體外受精，按10萬條/m1密度將精子加入有卵子的培養(yǎng)孔中，18～20小時(shí)后，根據(jù)原核及第二極體數(shù)檢查受精情況。如果是通過ICSI，取卵后2小時(shí)左右，用0.5mg/ml透明質(zhì)酸酶將卵子外的卵丘消化，再用拉制的玻璃細(xì)管將卵子外的顆粒細(xì)胞去除。檢查卵子的完好及成熟度，對(duì)有**極體的核成熟卵子行ICSI。先將精子置于5%的聚乙烯吡咯烷酮中，經(jīng)尾部制動(dòng)后，尾端向前吸人微注射針中，轉(zhuǎn)移**含HEPEs的HTF管中，保持卵子**極體于6點(diǎn)或12點(diǎn)位置，由3點(diǎn)進(jìn)針，抽吸少量胞漿以確定卵膜穿透后，將精子置于卵胞漿中央。ICSI后，卵子轉(zhuǎn)移**HTF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，次日檢查受精情況。
③第3天，觀察胚胎，如果8細(xì)胞I～Ⅱ級(jí)胚胎數(shù)大于3個(gè)，胚胎轉(zhuǎn)入已經(jīng)平衡過夜的囊胚培養(yǎng)皿內(nèi)，評(píng)級(jí)高的胚胎集中培養(yǎng)，碎片含量較多或細(xì)胞大小不一胚胎單個(gè)培養(yǎng)。第3天胚胎未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者，當(dāng)天移植回子宮。
④檢查囊胚形成率并進(jìn)行評(píng)分，選擇移植或冷凍用胚胎。取卵后第5天，評(píng)估胚胎質(zhì)量，確定胚胎能否用于移植和冷凍。如果再第5天，不能形成囊胚，換液后胚胎繼續(xù)培養(yǎng)1天．在第6天評(píng)估是否能用于移植和冷凍。遲于第7天上午形成囊胚者不能再繼續(xù)培養(yǎng)。